Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Diese Forschung wurde finanziert durch das US Department of Defense in Form eines Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastischer Anämie & MDS Foundation Grant, und UMRB Grant, M.M. Authors Danke Mohit Jaiswal und Subhradeep Bhar für erste Klonen von TET2 in pDEST14 Vektor.

1. Klonen und Reinigung des unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase
<ol><li>Klonen Sie menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) in den pDEST14-Ziel-Vektor mit der ortsspezifische Rekombination Technik wie zuvor beschrieben22. Hinweis: Frühere Studien haben gezeigt, dass die C-terminale TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) Domäne der minimalen katalytisch aktiven Domain21,23. Um die unmarkierten TET2 D...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain.">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development.">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li><li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development.">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li><li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids.">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

Mutationen im TET2-gen sind einige der am häufigsten gefundenen genetischen Veränderungen bei Patienten mit unterschiedlichen hämatopoetischen Malignome. Bis heute hunderte von verschiedenen TET2 Mutationen, darunter Unsinn, Frame-Shift und Missense-Mutationen wurden in Patienten12identifiziert. Patienten mit TET2 Mutationen zeigen niedrige Konzentrationen von genomischen 5hmC im Knochenmark, im Vergleich zu denen mit wt-TET214. Mutierte TET2 Knock-in E...

Die C5-Position von Cytosin-Basen innerhalb von CpG dinucleotid ist die vorherrschende Methylierung-Website (5mCpG) in Säugetier-Genome1. Eine Reihe neuerer Studien haben darüber hinaus umfangreiche C5 Cytosin Methylierung (5mC) in nicht-CpG Websites entdeckt (5mCpH, wo H = A, T, oder C)2,3. 5mC Änderung dient als transkriptioneller Schalldämpfer bei endogenen Retrotransposons und Gen Promotoren3,4,5. DNA-Methylierung bei 5mC spielt auch eine wichtige Rolle im x-Chromosom Inaktivierung, gen Prägung, nukleare Neuprogrammierung und gewebespezifische Gen Ausdruck5,6,7. Methylierung von Cytosin an der C5-Position erfolgt durch DNA-Methyltransferasen und Mutationen in diesen Enzymen verursachen erhebliche Entwicklungsschäden8. Die Entfernung von 5mC Marken werden von TET1-3 5mC oxidasen9,10initiiert. Diese Dioxygenases TET-Familie wandeln 5mC in 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-FU) und 5-Carboxylcytosine (5caC) durch sequentielle Oxidation Schritte11,12,13. Schließlich ersetzt Thymin-DNA-Glycosylase 5fC oder 5caC zu unveränderten Cytosin mit base Excision Repair Weg11.
Das menschliche Gen TET2 wurde als ein häufig mutierte Gen in vielfältigen hämatopoetischen Malignome einschließlich myelodysplastischen Syndromen (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative Neoplasmen (identifiziert. MDS-MPN), und akute myeloische Leukämie (AML) aus MDS und MDS-MPN16. Die Höhe der 5hmC Änderung im Knochenmark DNA sind niedriger bei Patienten mit TET2 Mutationen im Vergleich zu denen mit Wildtyp (wt)-TET214. Eine Anzahl von Gruppen entwickelten TET2-Knockout-Maus-Modellen um ihre Rolle bei der normalen Hämatopoese und myeloischer Transformation17,18,19,20zu erhellen. Diese Mäuse mit Mutationen im TET2-gen wurden zunächst normal und lebensfähig, aber vielfältige hämatopoetischen Malignome manifestiert, als sie im Alter von ihrem frühen Tod verursacht. Diese Studien zeigten die wichtige Rolle der wt-TET2 in normaler Hämatopoetischer Differenzierung. Diese Maus-Modellen, die heterozygot Hämatopoetischen Stammzellen (TET2+ / HSCs) und homozygot TET2- / - hatte HSCs einen Wettbewerbsvorteil gegenüber homozygot wt-TET2 HSCs in repopulating hämatopoetische Linien als beide TET2+ /- und TET2- / - Hsz entwickelt vielfältige hämatopoetischen Malignome17,18. Diese Studien zeigen, dass Haploinsufficiency von TET2 Dioxygenase verändert die Entwicklung von Hsz und hämatopoetische Tumoren führt.
Ähnlich wie Mäuse mit Mutationen im TET2-gen, die meisten Leukämie-Patienten manifestieren Haploinsufficiency TET2 Dioxygenase Aktivität. Diese meist heterozygoten somatischen Mutationen sind Frame-Shift und Unsinn Mutationen, die verstreut im ganzen TET2 gen Körper während Missense-Mutationen, die meisten sind gruppiert in der Dioxygenase Domäne12. Bisher ist wenig Charakterisierung des wt und Mutant-TET2 in der Literatur vor allem aufgrund von Schwierigkeiten mit der Produktion von TET2-Dioxygenase und seine Assay21beschrieben. Hier berichten wir über einer einfachen einstufigen Läuterung der native TET2 Dioxygenase mit Ionenaustausch-Chromatographie. Darüber hinaus wurde eine quantitative LC-MS/MS-Assay optimiert und verwendet, um die enzymatische Aktivität von native TET2 Dioxygenase messen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

Die epigenetische Transkription Verordnung vermittelt durch 5-Methylcytosine (5mC) hat in eukaryotischen Entwicklung eine entscheidende Rolle gespielt. Demethylierung dieser epigenetischen Markierungen geschieht durch sequentielle Oxidation durch zehn-elf Translokation Dioxygenases (TET1-3), gefolgt von Thymin-DNA-Glycosylase-abhängige base Excision Repair. Inaktivierung des Gens TET2 aufgrund von genetischen Mutationen oder durch andere epigenetischen Mechanismen ist verbunden mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten, vor allem hämatopoetischen Malignome. Hier beschreiben wir eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des enzymatisch aktive unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase mit KATIONENAUSTAUSCH-Chromatographie. Weiter bieten wir einen flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Ansatz, der trennen und die vier normale DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5-Methyl, 5-Hydroxymethyl, 5-Formyl und 5-Carboxylgruppen) zu quantifizieren. Dieser Test kann verwendet werden, um die Aktivität der Wildtyp und Mutanten TET2 Dioxygenases zu bewerten.

Dynamisierung der 5mC in der DNA durch Dioxygenases TET-Familie spielt eine wichtige Rolle in epigenetische transkriptionelle Verordnungen. TET2 Dioxygenase ist häufig in diversen hämatopoetischen Tumoren12mutiert. Um die Rolle des Enzyms TET2 in der normalen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen, haben wir seine minimale katalytisch aktiven Domain ohne jede Affinität-Tag in pDEST14 Vector22geklont. Die unmarkierten TET2 Dioxygenase en...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Epigenetik und TET2 vermittelt 5-Methylcytosin-Demethylierung Feld eine solche Analyse der Aktivität der normalen und klinischen TET2-Mutationen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass natives TET2 in einem einzigen Schritt gereinigt werden kann, und seine Aktivität kann in Bezug auf die Bildung aller drei Produkte analysiert werden. Mehrere Absolventen werden das Verfahren demonstrieren.Die Proteinreinigung wird von Chayan Bhattacharya, dem TET2-Assay von Aninda Sundary Dey und der LC-MS/MS-Analyse von Navid Ayon durchgeführt. Für die bakterielle Transformation fügen Sie einen Mikroliter rekombinanten pDEST 14 Zielexpressionsvektor, der nicht markierte menschliche TET2-Dioxygenase enthält, 100 Mikroliter chemisch kompetenter E.coli BL21 DE3-Zellen in einer 1,7-Milliliter-Röhre hinzu. Nach einer Inkubation auf Eis für mindestens 15 Minuten, Hitze schockieren die Mischung bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden in einem Wasserbad.Unmittelbar nach einem Hitzeschock die Zellen für mindestens zwei Minuten wieder auf Eis legen. Fügen Sie danach 250 Mikroliter superoptimale Brühe mit Katabolitenrepression in die Zellen ein. Inkubieren Sie die Bakterienzellen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem Shaker.Nach der Inkubation die Zellen durch Zentrifugieren des Rohres bei 9.000-facher Schwerkraft für eine Minute nach unten drehen. 70% des Überstandes durch Pipetten entsorgen und das Pellet in den verbleibenden Medien auflösen. Die Zellsuspension auf einer Lirua-Brühe-Agarplatte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin verteilen.Inkubieren Sie die Platte für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie eine isolierte Kolonie aus und impfen Sie sie in 10 Milliliter LB-Ampicillin-Medien. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius in einem Shaker über Nacht.Danach verwenden Sie 100 Mikroliter Bakterienkultur, um 100 Milliliter LB-Ampicillinmedien als Primärkultur zu impfen. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius in einem Shaker über Nacht. Am nächsten Tag impfen Sie 15 Kolben, die jeweils 600 Milliliter LB-Ampicillinmedien mit sechs Millilitern Primärkultur pro Kolben enthalten.Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 180 U/min. Um die Dichte der Bakterienkultur zu überprüfen, messen Sie ihre optische Dichte mit 600 Nanometern oder OD600 mit einem Spektralphotometer. Nachdem die Kultur bei OD600 eine Dichte von 0,8 erreicht hat, induzieren Sie die Expression von TET2-Protein mit 300 Mikrolitern eines Molaren IPTG in jedem Kolben und wachsen Sie die Kultur für weitere 16 Stunden bei 17 Grad Celsius.Nach der Inkubation die Bakterienkultur auf Zentrifugenflaschen übertragen. Zentrifuge die Bakterienkultur, die das TET2-Enzym bei 5, 250-facher Schwerkraft für 45 Minuten ausdrückt. Verwenden Sie das bakterielle Pellet für die TET2-Reinigung.Arbeiten Auf Eis oder bei vier Grad Celsius, setzen Sie das bakterielle Pellet in 100 Milliliter 50-Millimolar MES Puffer, pH sechs. Nehmen Sie dann fünf Milliliter der Zellsuspension und bringen Sie sie mit dem Puffer auf 45 Milliliter. Sonicate die Federung für fünf mal 30 Sekunden bei Leistung 20, mit 60-Sekunden-Kühlintervallen.Drehen Sie das Lysat bei 5, 250-fache Schwerkraft für 45 Minuten. Sammeln Sie den Überstand, der das lösliche TET2-Enzym enthält, und leiten Sie ihn durch 0,45 Mikron-Filter, bevor Sie auf ein FPLC-System geladen werden. Packen Sie 30 Milliliter eines starken Kationenaustauschharzes in eine FPLC-Säule.Mit einem FPLC-System die Säule mit 10 Bettvolumen Waschpuffer bei konstanter Durchflussrate von 0,3 Millilitern pro Minute ausdemieren. Das geklärte Lysat auf die vorausgeglichene Säule legen und mit ca. 10 Bettvolumen Waschpuffer waschen, bis der Durchfluss klar wird. Elute TET2 mit einem 0 bis 10%gradienten vom Waschpuffer zum Elutionspuffer in 15 Bettvolumen, gefolgt von einem Haltepunkt bei 10%Elutionspuffer für zwei Bettvolumina.Sammeln Sie 100 Mikroliter Proben von Zelllysat vor und nach dem Laden der Spalte, zusammen mit allen Elutionsfraktionen, und analysieren Sie auf 10%auflösendes SDS-PAGE-Gel. Die Fraktionen, die TET2-Protein enthalten, zu bündeln und das Protein gefrieren. Dann lösen Sie das Enzym in 10 Milliliter Wasser auf und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.Führen Sie alle Demethylierungsreaktionen in Dreifachlizierung mit drei Mikrogramm Substrat durch. Fügen Sie 100 Mikrogramm gereinigtes TET2-Enzym zu 50 Mikrolitern des gesamten Reaktionspuffers hinzu. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 Grad, löschen Sie die TET2 katalysierte Oxidationsreaktionen mit fünf Mikroliter 500-Millimolar EDTA.Um Proben für die Analyse vorzubereiten, trennen Sie die DNA von der TET2-Reaktionsmischung, indem Sie zunächst 100 Mikroliter Oligo-Bindungspuffer zu 55 Mikroliter nadierter Reaktion hinzufügen. Danach 400 Mikroliter 100% Ethanol in das Gemisch geben. Diese Mischung durch eine Oligo-Bindungsspalte passieren.Nach dem Waschen der gebundenen DNA mit 750 Mikroliter Waschpuffer, elute die DNA in 20 Mikroliter Wasser. Verdauen Sie nun die isolierte DNA mit zwei Einheiten DNase I und 60 Einheiten S1-Nuklease bei 37 Grad Celsius für 12 Stunden, um einzelne Nukleosidmonophosphate zu produzieren. Nach der Verdauung zwei Einheiten kalbendarmer alkalischer Phosphatase in die Proben geben.Inkubieren Sie für eine Zugabe 12 Stunden bei 37 Grad Celsius, um die terminalen Phosphatgruppen aus den Nukleosidmonophosphaten zu entfernen und die Nukleoside zu erhalten. Bereiten Sie eine 100-Mikromolar-Stammlösung aller modifizierten Cytosin-Nukleoside und der normalen DNA-Basen in HPLC-Wasser für die Entwicklung der LC-MS/MS-Methode vor. Optimieren Sie die nukleosidabhängigen MS/MS-Parameter, indem Sie Im erweiterten MS-Scanmodus Nachspiellösungen nacheinander in das Massenspektrometer mit einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute einfließen lassen.Mehrere Parameter können mit der automatisierten quantitativen Optimierungsfunktion der Software für jedes DNA-Nukleosid optimiert werden. Optimieren Sie an dieser Stelle die verbleibenden Parameter für jedes DNA-Nukleosid mit der manuellen quantitativen Optimierungsfunktion der Software im Strömungsinjektionsanalysemodus. Optimieren Sie nun quellenabhängige MS/MS-Parameter, indem Sie 10 Mikroliter Der Stammlösung mit einem Gradienten mit 25 % Lösungsmittel B bei einer Durchflussrate von 0,3 Milliliter pro Minute injizieren.Um alle acht DNA-Nukleoside zu trennen, führen Sie eine Flüssigchromatographie durch, wie im Textprotokoll auf einer C18-Säule beschrieben. Schließlich können Sie alle Nukleoside mit der LC-MS/MS-Methode in Standardkurven erkennen und quantifizieren. Da die katalytische Domäne von TET2 im Vergleich zu den meisten einheimischen E.coli-Proteinen einen relativ hohen isoelektrischen Punkt aufweist, wurde ein effizienter Reinigungsprozess unter Verwendung einer Kationenaustauschchromatographie entwickelt.Diese Reinigung ergab mehr als 90% reines TET2-Enzym in einem einzigen Schritt. Um verschiedene Desoxycytidinderivate und die vier natürlichen DNA-Basen nach der tet2-enzymatischen Reaktion zu trennen und zu quantifizieren, wurde ein empfindlicher LC-MS/MS-basierter Assay optimiert. Standardkurven wurden mit seriellen Verdünnungen eines Gemischs gezeichnet, das alle Nukleoside enthält.Die Ergebnisse der Flüssigchromatographie MS/MS-Methode werden hier gezeigt. Das Verfahren ermöglicht die Trennung und Quantifizierung der vier normalen DNA-Basen sowie der vier modifizierten Cytosinbasen. In diesem experimentellen Verfahren beschreiben wir das Klonen von nicht markierten menschlichen TET2-Dioxynase-Katalytisch-Domänen mit standortspezifischer Rekombinationstechnik und einer ausreichenden Expression in einem Zielvektor in E.Coli.Wir reinigten effizient unmarkiertes TET2-Enzym unter Verwendung der Kationenaustauschchromatographie, um in einem einzigen Schritt eine Reinheit von mehr als 90 % zu erzielen. Darüber hinaus haben wir eine neuartige Flüssigchromatographie-Methode entwickelt, um die vier normalen DNA-Basen und die vier modifizierten Cytosinbasen zu trennen. Um die acht Nukleoside aus TET2-Katalysereaktionen zu quantifizieren, haben wir unsere verbesserte Flüssigchromatographie-Methode mit der Tandem-Massenspektrometrie gekoppelt.Der empfindliche LC-MS/MS-Assay wurde dann verwendet, um die Aktivität des rekombinanten nicht markierten menschlichen TET2-Enzyms zu bestimmen. Der hier beschriebene Ansatz wird die Bewertung von Wildtyp und mutierter TET2-Dioxygenase erheblich verbessern.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry - Eine Methode zur Beurteilung der thermischen Stabilität und Konformation von Protein-Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...