Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי לנו משרד ההגנה בדמות בפרס Idea (W81XWH-13-1-0174), אנמיה אפלסטית & מענק קרן MDS, ותודה UMRB גרנט למחברים ועותרת מוהיט Jaiswal ו Subhradeep Bhar שכפול הראשונית של TET2 ב pDEST14 וקטורית.

1. שיבוט ולטיהור TET2 אנושיות לא מתויגות Dioxygenase
<ol><li>לשבט TET2 אדם dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) לתוך הווקטור היעד pDEST14 בטכניקה רקומבינציה בייעודי לאתר כפי שתואר לעיל22. הערה: מחקרים קודמים הדגימו כי התחום dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) TET2 C-מסוף הוא מינימלי תחום catalytically active21,<s...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain.">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development.">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li><li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development.">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li><li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids.">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

מוטציות בגן TET2 הם חלק לשינויים גנטיים שזוהו בתדירות הגבוהה ביותר בחולים עם ממאירויות hematopoietic מגוונות. עד כה מאות של מוטציות TET2 שונים, הכוללים שטויות, מסגרת-shift ו missense מוטציות, זוהו חולים12. חולים עם מוטציות TET2 מראים רמות נמוכות של 5hmC גנומית במח העצם בהשוואה לאלו עם wt-TET2<sup class...

המיקום C5 של ציטוזין בסיסים בתוך CpG dinucleotides הוא אתר מתילציה הדומיננטית (5mCpG) הגנום בתרבית של1. בנוסף, מספר מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו נרחב מתילציה ציטוזין C5 (5mC) באתרים שאינם-CpG (5mCpH, איפה H = A, T, או C)2,3. השינוי 5mC משמש משתיק קול תעתיק retrotransposons אנדוגני, ג'ין היזמים3,4,5. מתילציה DNA-5mC גם ממלא תפקידים חשובים איון כרומוזום X, ג'ין החתמה, התכנות גרעינית, רקמות ספציפיות ג'ין ביטוי5,6,7. מתילציה של ציטוזין במיקום C5 מבוצע על ידי ה-DNA methyltransferases, ולגרום מוטציות בגן אנזימים אלה ליקויים התפתחותיים משמעותיים8. הסרת סימני 5mC מבוצעים על-ידי-TET1-3 5mC oxidases9,10. אלה dioxygenases ט-המשפחה להמיר 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) ו- 5-carboxylcytosine (5caC) על ידי חמצון רציפים צעדים11,12,13. לבסוף, תימין-DNA glycosylase מחליפה 5fC או 5caC כדי שלא שונתה ציטוזין באמצעות כריתה בסיס תיקון מסלול11.
הגן TET2 האנושי זוהה גן שעבר מוטציה בתדירות גבוהה בממאירות hematopoietic מגוונים כולל myelodysplastic תסמונות (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative (neoplasms MDS-MPN), ו לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) שמקורם MDS ועוד MDS-MPN16. הרמות של שינוי 5hmC במח העצם DNA נמוכים בחולים עם מוטציות TET2 בהשוואה לאלו עם פראי סוג (wt)-TET214. מספר קבוצות פיתחו מודלים העכבר TET2-נוקאאוט התירי את תפקידה hematopoiesis רגיל וטרנספורמציה מיאלואידית17,18,19,20. אלו עכברים עם מוטציות בגן TET2 היו רגילים בתחילה בר -קיימא, אך באה לידי ביטוי מגוונות ממאירות hematopoietic כפי שהם הזדקנו גרימת מוות מוקדם שלהם. מחקרים אלו הראו את התפקידים החשובים בגילומו של TET2-wt ב בידול hematopoietic רגילה. מודלים אלה העכבר משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים תאי גזע hematopoietic (TET2+ /- HSCs), homozygous TET2- / - HSCs היו יתרון תחרותי על פני wt homozygous-TET2 HSCs ב לאכלס מחדש שושלות hematopoietic כמו שני TET2+ /- TET2- / - HSCs פיתחה מגוון גידולים ממאירים hematopoietic17,18. מחקרים אלה מדגימים את haploinsufficiency של TET2 dioxygenase הפיצולים הפיתוח של HSCs ותוצאות hematopoietic ממאירות.
בדומה לעכברים עם מוטציות בגן TET2, רוב חולי לוקמיה להתבטא haploinsufficiency של TET2 dioxygenase פעילות. מוטציות סומאטית בעיקר משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים אלה כוללות מסגרת-shift ושטויות מוטציות התפזרו בכל הגוף ג'ין TET2 תוך מוטציות missense ביותר באזור התחום dioxygenase12. עד כה, אפיון קטן של מוטציה, wt ו TET2 מדווח בספרות בעיקר עקב קשיים עם הייצור של TET2 dioxygenase ואת וזמינותו שלה21. כאן, מדווחים על טיהור צעד אחר צעד פשוט של יליד dioxygenase TET2 באמצעות כרומטוגרפיה יונים. עוד, וזמינותו כמותית LC-MS/MS היה ממוטב, המשמש למדידת פעילות אנזימטי של יליד TET2 dioxygenase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

הסדרת שעתוק epigenetic מתווכת על-ידי 5-methylcytosine (5mC) שיחק תפקיד קריטי בהתפתחות האיקריוטים. Demethylation של אלה סימני epigenetic מושגת על ידי חמצון רציף על ידי 10-11 טרנסלוקציה dioxygenases (TET1-3), ואחריו התיקון glycosylase תלוית בסיס כריתה תימין-DNA. איון של הגן TET2 עקב מוטציות גנטיות, או על ידי אחרים מנגנוני epigenetic מזוהה עם פרוגנוזה גרועה אצל חולים עם סרטן מגוונות, במיוחד hematopoietic ממאירות. כאן, אנו מתארים של טיהור יעיל צעד בודד של enzymatically הפעיל לא מתויגות האנושי TET2 dioxygenase באמצעות כרומטוגרפיה קטיונים. אנו מספקים נוסף בגישה ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) זה יכול להפריד ולכמת את ארבעת הרגיל DNA בסיסים (A, T, G ו- C), כמו גם ארבעה בסיסי ציטוזין ששונתה (5-מתיל, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, 5-carboxyl). Assay זה יכול לשמש כדי להעריך את הפעילות של פראי סוג של מוטציה TET2 dioxygenases.

שינוי דינמי של 5mC ב- DNA על-ידי dioxygenases ט-המשפחה ממלאת תפקידים חשובים בתקנות תעתיק epigenetic. TET2 dioxygenase הוא מוטציה בתדירות גבוהה מגוונות ממאירות hematopoietic12. כדי לחקור את התפקיד של האנזים TET2 להתפתחות התקינה, מחלה, לנו יש משובטים המחשבים catalytically פעיל מינימלי ללא כל זיקה ת?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

כאן, אנו מציגים עבור טיהור יעיל צעד בודד של האדם לא מתויגות הפעיל פרוטוקול 10-11 טרנסלוקציה-2 (TET2) dioxygenase 5-methylcytosine באמצעות יונים כרומטוגרפיה ואת וזמינותו שלה באמצעות מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS/MS)-המבוסס על הגישה.

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח אפיגנטיקה TET2 מתווך 5-Methylcytosine demethylation שדה כזה ניתוח של פעילות של מוטציות TET2 נורמלי וקליני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי TET2 יליד ניתן לטהר בשלב אחד, ואת פעילותה ניתן לנתח במונחים של היווצרות של כל שלושת המוצרים. מספר סטודנטים לתארים מתקדמים יפגינו את ההליך.טיהור החלבון יתבצע על ידי Chayan Bhattacharya, ההסתערות TET2 על ידי אנינדה Sundary Dey, וניתוח LC-MS /MS על ידי נאביד Ayon. עבור טרנספורמציה חיידקית, להוסיף מיקרוליטר אחד של רקומביננטי pDEST 14 וקטור ביטוי היעד המכיל דיוקסיגנאאז TET2 אנושי לא מתויג ל 100 microliters של תאי E.coli BL21 DE3 מוכשרים כימית בצינור 1.7 מיליליטר. לאחר הדגירה על הקרח במשך 15 דקות לפחות, החום מזעזע את התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות באמבט מים.מיד לאחר הלם חום, מניחים את התאים בחזרה על הקרח למשך שתי דקות לפחות. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט לתאים. דגירה התאים החיידקיים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר.לאחר הדגירה, לסובב את התאים על ידי צנטריפוגה הצינור ב 9, 000 פעמים כוח הכבידה לדקה אחת. השלך 70% מהעל-טבעי על-ידי צינורות, והמס את גלולת הכדור במדיה הנותרת. מורחים את ההשעיה התא על צלחת אגר מרק Lirua המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.דגירה הצלחת במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. בחר מושבה מבודדת אחת, וחסן אותה לתוך 10 מיליליטר של מדיה אמפיצילין LB. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר לילה.בעקבות זאת, להשתמש 100 microliters של תרבות החיידקים כדי לחסן 100 מיליליטר של מדיה אמפיצילין LB כתרבות ראשונית. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר לילה. למחרת, לחסן 15 בקבוקונים, כל אחד מכיל 600 מיליליטר של מדיה אמפיצילין LB עם שישה מיליליטר של התרבות העיקרית לכל בקבוק.דגירה flasks ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר ב 180 סל"ד. כדי לבדוק את הצפיפות של תרבות החיידקים, למדוד את הצפיפות האופטית שלה ב 600 ננומטר, או OD600, באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר שהתרבות מגיעה לצפיפות של 0.8 ב- OD600, יש לגרום לביטוי של חלבון TET2 עם 300 מיקרוליטרים של IPTG טוחן אחד בכל בקבוקון, ולגדל את התרבות למשך 16 שעות נוספות ב-17 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, מעבירים את תרבות החיידקים לבקבוקי צנטריפוגה. צנטריפוגה התרבות החיידקית המבטאת את האנזים TET2 ב 5, 250 פעמים כבידה במשך 45 דקות. השתמש גלולה חיידקי לטיהור TET2.עובד על קרח או בארבע מעלות צלזיוס, להשעות מחדש את גלולת החיידקים ב 100 מיליליטר של חיץ MES 50 מילימולאר, pH שש. ואז לקחת חמישה מיליליטר של ההשעיה התא, ולהביא אותו ל45 מיליליטר עם החיץ. Sonicate ההשעיה במשך חמש פעמים 30 שניות בחשמל 20, עם מרווחי קירור 60 שניות.לסובב את lysate ב 5, 250 פעמים כבידה במשך 45 דקות. לאסוף את supernatant המכיל את האנזים TET2 מסיס, ולהעביר אותו דרך מסנני 0.45 מיקרון לפני טעינה על מערכת FPLC. לארוז 30 מיליליטר של שף חילופי קטיונים חזק לתוך עמודת FPLC.לצייד את העמוד עם 10 נפחי מיטה של חיץ לשטוף בקצב זרימה קבוע של 0.3 מיליליטר לדקה באמצעות מערכת FPLC. טוענים את התמיסה המובהרת על העמודה המופחתת מראש, ושוטפים בכ-10 כרכים של חיץ שטיפה עד שהזרימה הופכת ברורה. Elute TET2 באמצעות אפס עד 10% הדרגתי ממאגר הכביסה למאגר האלוטיון בנפחי 15 מיטות, ואחריו אחיזה במאגר של 10%elution עבור שני אמצעי אחסון של מיטות.לאסוף 100 דגימות microliter של lysate התא לפני ואחרי טעינת עמודה, יחד עם כל שברי elution, ולנתח על 10%פתרון SDS-PAGE ג'ל. בריכת שברים המכילים חלבון TET2, להקפיא לייבש את החלבון. ואז להמיס את האנזים ב 10 מיליליטר של מים, ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.בצע את כל התגובות demethylation ב טריפליקט עם שלושה מיקרוגרם של מצע. הוסף 100 מיקרוגרם של אנזים TET2 מטוהר ל 50 microliters של מאגר התגובה הכולל. לאחר דגירה של שעה אחת ב-37 מעלות, הרוו את תגובות החמצון הממוזערות של TET2 עם חמישה מיקרוליטרים של EDTA 500 מילימולרי.כדי להכין דגימות לניתוח, להפריד את ה-DNA מתערובת התגובה TET2 על ידי הוספת תחילה 100 microliters של מאגר מחייב אוליגו ל 55 microliters של תגובה מרווה. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של 100% אתנול לתערובת. מעבירים את התערובת דרך עמודת כריכת אוליגו.לאחר שטיפת הדנ"א הכבול עם 750 מיקרוליטרים של חיץ כביסה, יש לחמק מהדנ"א ב-20 מיקרוליטרים של מים. עכשיו, לעכל את ה-DNA מבודד עם שתי יחידות של DNase אני ו 60 יחידות של נוקלאאז S1 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות כדי לייצר מונופוספטים נוקליאוסיד בודדים. לאחר העיכול, להוסיף שתי יחידות של פוספטזה אלקליין מעיים עגל לדגימות.דגירה לתוספת של 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את קבוצות פוספט מסוף מן מונופוספטים nucleoside, ולקבל את הנוקלאוזידים. הכן פתרון מלאי של 100 מיקרומולרים של כל גרעיני הציטוסין ששונו, ואת בסיסי הדנ"א הרגילים במים ברמת HPLC לפיתוח שיטת LC-MS/MS. מטב את הפרמטרים MS/MS התלויים בגרעין על-ידי החדרת פתרונות מלאי בזה אחר זה בספקטרומטר המסה בקצב זרימה של 10 מיקרוליטרים לדקה במצב סריקת טרשת נפוצה משופרת.ניתן לייעל מספר פרמטרים באמצעות תכונת האופטימיזציה הכמותית האוטומטית של התוכנה עבור כל גרעין DNA. בשלב זה, לייעל את הפרמטרים הנותרים עבור כל nucleoside DNA באמצעות תכונת אופטימיזציה כמותית ידנית של התוכנה במצב ניתוח הזרקת זרימה. כעת, מטב פרמטרי MS/MS תלויי מקור על-ידי הזרקת 10 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי באמצעות שיפוע עם 25% ממס B בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה.כדי להפריד את כל שמונת נוקלאוזידים DNA, לבצע כרומטוגרפיה נוזלית כמפורט בפרוטוקול הטקסט בעמודה C18. לבסוף, לזהות ולכרות את כל הגרעינים באמצעות שיטת LC-MS/MS בעקומות סטנדרטיות. מאז התחום הקטאליטי של TET2 יש נקודה איסואלקטרית גבוהה יחסית בהשוואה לרוב החלבונים הילידים E.coli, תהליך טיהור יעיל ניצול כרומטוגרפיה חילופי קטיון פותחה.טיהור זה הניב יותר מ 90% אנזים TET2 טהור בשלב אחד. על מנת להפריד ולכומת נגזרות deoxycytidine שונות וארבעת בסיסי ה- DNA הטבעיים בעקבות התגובה האנזימטית TET2, LC-MS / MS רגיש מבוסס חקירה היה אופטימיזציה. עקומות סטנדרטיות צוירו באמצעות דילול סדרתי של תערובת המכילה את כל הנוקלאוזידים.תוצאות שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית MS/MS מוצגות כאן. השיטה מאפשרת הפרדה וכימות של ארבעת בסיסי הדנ"א הרגילים, כמו גם ארבעת בסיסי הציטוסין ששונו. בהליך ניסיוני זה, אנו מתארים את השיבוט של תחום קטליטי TET2 dioxynase אנושי לא מתויג באמצעות טכניקת קומבינציה ספציפית לאתר וביטוי מספיק בווקטור יעד ב- E.Coli.טיהרנו ביעילות אנזים TET2 לא מתויג תוך שימוש בכרומטוגרפיה של חילופי קיט כדי להניב יותר מ-90% טוהר בשלב אחד. יתר על כן, פיתחנו שיטת כרומטוגרפיה נוזלית חדשנית כדי להפריד בין ארבעת בסיסי הדנ"א הרגילים וארבעת בסיסי הציטוסין ששונו. כדי לכמת את שמונת הנוקלאוזידים מתגובות קטליזציה TET2, יש לנו יחד עם שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית המשופרת שלנו עם ספקטרומטריית מסת טנדם.LC-MS/ MS רגיש assay היה אז מנוצל כדי לקבוע את הפעילות של אנזים TET2 אנושי רקומביננטי לא מתויג. הגישה המתוארת כאן תשפר מאוד את הערכת השווי של סוג פראי מוטנט TET2 דיוקסיגנאז.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...