Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dal dipartimento della difesa sotto forma di un'Idea Award (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplastica & MDS Foundation Grant e grant UMRB a M.M. Authors ringraziare Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar per clonazione iniziale di TET2 nel vettore pDEST14.

1. clonazione e purificazione di TET2 umana senza tag diossigenasi
<ol><li>Clone umano TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) nel vettore pDEST14 destinazione usando la tecnica di ricombinazione site-specific come descritto in precedenza22. Nota: Gli studi precedenti hanno dimostrato che il dominio C-terminale TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) è il minimo cataliticamente attiva dominio21,23. Per poter esprimere...

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

Mutazioni nel gene TET2 sono alcuni dei cambiamenti genetici più frequentemente rilevati in pazienti con malignità ematopoietiche diversificata. Ad oggi centinaia di diverse mutazioni di TET2, sono sciocchezze, frame-shift e mutazioni di senso sbagliato, sono state identificate in pazienti12. Pazienti con mutazioni di TET2 mostrano bassi livelli di genomica 5hmC nel midollo osseo rispetto a quelli con wt-TET214. TET2 mutante knock-in esperimenti hanno ri...

La posizione di C5 della citosina basi all'interno di dinucleotidi CpG è il sito di metilazione predominante (5mCpG) nel genoma di mammiferi1. Inoltre, una serie di studi recenti hanno scoperto vasta metilazione della citosina C5 (5mC) in siti non-CpG (5mCpH, dove H = A, T, o C)2,3. modifica di 5mc serve come un silenziatore trascrizionale retrotrasposoni endogeno e gene promotori3,4,5. La metilazione del DNA a 5mC inoltre svolge ruoli importanti nell'inattivazione del cromosoma X, gene imprinting, riprogrammazione nucleare e genica tessuto-specifica espressione5,6,7. La metilazione della citosina nella posizione C5 è svolta da methyltransferases del DNA e le mutazioni in questi enzimi causano difetti inerenti allo sviluppo significativo8. La rimozione di segni di 5mC vengono avviate da TET1-3 5mC ossidasi9,10. Questi diossigenasi TET-famiglia convertono 5mC in 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) di ossidazione sequenziale passaggi11,12,13. Infine, timina-DNA glicosilasi sostituiscono 5fC o 5caC a citosina non modificato utilizzando riparazione bassa di asportazione percorso11.
Il gene TET2 umano è stato identificato come un gene mutato frequentemente in varie malignità ematopoietiche compreso myelodysplastic (MDS) le sindromi14,15,16, neoplasie mieloproliferative MDS ( MDS-MPN) e leucemia mieloide acuta (AML) provenienti da MDS e MDS-MPN16. I livelli di modificazione di 5hmC nel midollo osseo del DNA sono più bassi nei pazienti con mutazioni di TET2 rispetto a quelli con wild type (wt)-TET214. Alcuni gruppi hanno sviluppato modelli murini TET2 knock-out per delucidare il suo ruolo nell'ematopoiesi normale e trasformazione mieloide17,18,19,20. Questi topi con mutazioni del gene TET2 erano inizialmente normale e praticabile, ma manifesta varie malignità ematopoietiche come età causando la loro morte prematura. Questi studi hanno dimostrato il ruolo importante svolto da wt-TET2 nel differenziamento ematopoietico normale. In questi modelli di topo, cellule staminali ematopoietiche eterozigoti (TET2+ /- HSCs) e omozigotica TET2- / - HSCs aveva un vantaggio competitivo rispetto omozigoti wt-TET2 HSCs a ripopolare filiere emopoietiche come entrambi TET2+ /- e TET2- / - HSCs sviluppato varie malignità ematopoietiche17,18. Questi studi dimostrano che il haploinsufficiency di TET2 diossigenasi altera lo sviluppo di HSCs e risultati nelle malignità ematopoietiche.
Simili ai topi con mutazioni del gene TET2, maggior parte dei pazienti affetti da leucemia manifestano haploinsufficiency di TET2 diossigenasi attività. Queste mutazioni somatiche principalmente eterozigoti comprendono mutazioni frame-shift e sciocchezze dislocate in tutto il corpo del gene TET2 mentre mutazioni missenso che sono la maggior parte dei cluster nel dominio diossigenasi12. Fin qui, poco caratterizzazione di TET2 wt e mutante è segnalato nella letteratura principalmente a causa di difficoltà con la produzione di TET2 diossigenasi e relativi test21. Qui, segnaliamo un semplice singolo passaggio di purificazione del nativo dioxygenase di TET2 mediante cromatografia a scambio ionico. Ulteriormente, un dosaggio quantitativo di LC-MS/MS è stato ottimizzato e utilizzato per misurare l'attività enzimatica di nativo TET2 diossigenasi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

La regolazione della trascrizione epigenetica mediata da 5-metilcitosina (5mC) ha svolto un ruolo critico nello sviluppo eucariotico. Demetilazione di questi segni epigenetici avviene mediante ossidazione sequenza di dieci-undici traslocazione diossigenasi (TET1-3), seguita dalla riparazione bassa di asportazione glicosilasi-dipendente timina-DNA. Inattivazione del gene TET2 a causa di mutazioni genetiche o da altri meccanismi epigenetici è associato con una prognosi difficile in pazienti con diversi tipi di cancro, specialmente malignità ematopoietiche. Qui, descriviamo una purificazione efficiente singolo passaggio di enzimaticamente attivo dioxygenase di TET2 umana senza tag mediante cromatografia a scambio cationico. Forniamo inoltre un approccio liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che può separare e quantificare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5-metil, 5-idrossimetil, 5-formil e 5-carbossilico). Questa analisi può essere usata per valutare l'attività del wild type e mutanti TET2 diossigenasi.

Modifica dinamica di 5mC nel DNA di diossigenasi TET-famiglia svolge i ruoli importanti nel regolamento trascrizionale epigenetica. Dioxygenase di TET2 è frequentemente mutato in varie malignità ematopoietiche12. Per studiare il ruolo dell'enzima TET2 nello sviluppo normale e nella malattia, abbiamo clonato il suo dominio cataliticamente attivo minimo senza qualsiasi tag di affinità nel vettore pDEST1422. Il dioxygenase di TET2 senza tag ...

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Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.

Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in epigenetica e tet2 mediato campo di demetilazione 5-metilcitosina tale analisi dell'attività delle mutazioni TET2 normali e cliniche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il TET2 nativo può essere purificato in un unico passaggio e la sua attività può essere analizzata in termini di formazione di tutti e tre i prodotti. Diversi laureati diranno la procedura.La purificazione delle proteine sarà eseguita da Chayan Bhattacharya, il saggio TET2 di Aninda Sundary Dey e l'analisi LC-MS/MS di Navid Ayon. Per la trasformazione batterica, aggiungere un microlitro di vettore di espressione di destinazione pDEST 14 ricombinante contenente TET2 diossigenasi umana non registrata a 100 microlitri di cellule E.coli BL21 DE3 chimicamente competenti in un tubo da 1,7 millilitri. Dopo l'incubazione sul ghiaccio per almeno 15 minuti, scaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 30 secondi in un bagno d'acqua.Immediatamente dopo lo shock termico, riposizionare le cellule sul ghiaccio per un minimo di due minuti. In seguito, aggiungi 250 microlitri di brodo super ottimale con la repressione dei cataboliti alle cellule. Incubare le cellule batteriche per un'ora a 37 gradi Celsius in uno shaker.Dopo l'incubazione, spingi le cellule centrifugando il tubo a 9.000 volte la gravità per un minuto. Scartare il 70% del supernatante con la pipettazione e sciogliere il pellet nel supporto rimanente. Stendere la sospensione cellulare su una piastra di agar di brodo Lirua contenente 100 microgrammi per ampicillina millilitro.Incubare la piastra per 16 ore a 37 gradi Celsius. Selezionare una colonia isolata e inocularla in 10 millilitri di mezzi di ampicillina LB. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius in uno shaker durante la notte.In seguito, utilizzare 100 microlitri di coltura batterica per inoculare 100 millilitri di mezzi di ampicillina LB come coltura primaria. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius in uno shaker durante la notte. Il giorno successivo, inoculare 15 mastri, ognuno contenente 600 millilitri di mezzi di ampicillina LB con sei millilitri di coltura primaria per pallone.Incubare i contenitori a 37 gradi Celsius su uno shaker a 180 giri/min. Per controllare la densità della coltura batterica, misurare la sua densità ottica a 600 nanometri, o OD600, usando uno spettrofotometro. Dopo che la coltura raggiunge una densità di 0,8 a OD600, indurre l'espressione della proteina TET2 con 300 microlitri di un IPTG molare in ogni pallone e far crescere la coltura per altre 16 ore a 17 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, trasferire la coltura batterica in bottiglie di centrifuga. Centrifugare la coltura batterica esprimendo l'enzima TET2 a 5.250 volte la gravità per 45 minuti. Utilizzare il pellet batterico per la purificazione TET2.Lavorando sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius, sospendere di nuovo il pellet batterico in 100 millilitri di tampone MES da 50 millimolare, pH sei. Quindi prendere cinque millilitri della sospensione cellulare e portarlo a 45 millilitri con il tampone. Sonicare la sospensione per cinque volte 30 secondi a potenza 20, con intervalli di raffreddamento di 60 secondi.Ruotare il lysate a 5.250 volte la gravità per 45 minuti. Raccogliere il supernatante contenente l'enzima TET2 solubile e passarlo attraverso filtri da 0,45 micron prima di caricarlo su un sistema FPLC. Imballare 30 millilitri di una forte resina scambiata di cationi in una colonna FPLC.Equilibrare la colonna con 10 volumi di tampone di lavaggio alla portata costante di 0,3 millilitri al minuto utilizzando un sistema FPLC. Caricare il llysate chiarificato sulla colonna pre-equilibrata e lavare con circa 10 volumi di letto di tampone di lavaggio fino a quando il flusso non diventa chiaro. Elute TET2 con una sfumatura da zero a 10% dal buffer di lavaggio al buffer di eluizione in 15 volumi di letto, seguito da un blocco al buffer di eluizione del 10% per due volumi di letto.Raccogliere 100 campioni di microliter di lisato cellulare prima e dopo il caricamento della colonna, insieme a tutte le frazioni di eluizione, e analizzare sul gel SDS-PAGE risolutivo al 10%. Mettere in comune le frazioni contenenti proteine TET2 e congelare la proteina. Quindi sciogliere l'enzima in 10 millilitri di acqua e conservare a meno 80 gradi Celsius.Eseguire tutte le reazioni di demetilazione in triplice copia con tre microgrammi di substrato. Aggiungere 100 microgrammi di enzima TET2 purificato a 50 microlitri di tampone di reazione totale. Dopo un'ora di incubazione a 37 gradi, dissetare le reazioni di ossidazione catalizzate da TET2 con cinque microlitri di EDTA da 500 millimolari.Per preparare campioni per l'analisi, separare il DNA dalla miscela di reazione TET2 aggiungendo prima 100 microlitri di tampone di legame Oligo a 55 microlitri di reazione temprato. In seguito, aggiungere 400 microlitri di 100% di etanolo alla miscela. Passare questa miscela attraverso una colonna di legame Oligo.Dopo aver lavato il DNA legato con 750 microlitri di tampone di lavaggio, elutare il DNA in 20 microlitri di acqua. Ora, digerire il DNA isolato con due unità di DNA I e 60 unità di nucleasi S1 a 37 gradi Celsius per 12 ore per produrre singoli monofosfati nucleoside. Dopo la digestione, aggiungere due unità di fosfatasi alcalina intestinale del polpaccio ai campioni.Incubare per un'aggiunta di 12 ore a 37 gradi Celsius per rimuovere i gruppi fosfatici terminali dai monofosfati nucleoside e ottenere i nucleosidi. Preparare una soluzione di stock di 100 micromolari di tutti i nucleosidi citosina modificati e le normali basi di DNA in acqua di grado HPLC per lo sviluppo del metodo LC-MS/MS. Ottimizzare i parametri MS/MS nucleoside-dipendenti infondendo soluzioni stock una alla volta nello spettrometro di massa a una portata di 10 microlitri al minuto in modalità di scansione MS avanzata.Diversi parametri possono essere ottimizzati utilizzando la funzione di ottimizzazione quantitativa automatizzata del software per ogni nucleoside del DNA. A questo punto, ottimizzare i parametri rimanenti per ogni nucleoside del DNA utilizzando la funzione di ottimizzazione quantitativa manuale del software in modalità di analisi dell'iniezione di flusso. Ora, ottimizza i parametri MS/MS dipendenti dalla sorgente iniettando 10 microlitri di soluzione stock utilizzando un gradiente con il 25% di solvente B a una portata di 0,3 millilitri al minuto.Per separare tutti e otto i nucleosidi del DNA, eseguire la cromatografia liquida come descritto nel protocollo di testo su una colonna C18. Infine, rilevare e quantificare tutti i nucleosidi utilizzando il metodo LC-MS/MS nelle curve standard. Poiché il dominio catalitico del TET2 ha un punto isoelettrico relativamente alto rispetto alla maggior parte delle proteine indigene E.coli, è stato sviluppato un efficiente processo di purificazione che utilizza una cromatografia a scambio di cationi.Questa purificazione ha prodotto un enzima TET2 puro superiore al 90% in un unico passaggio. Al fine di separare e quantificare diversi derivati della deossicitidina e le quattro basi naturali di DNA a seguito della reazione enzimatica TET2, è stato ottimizzato un saggio sensibile a base di LC-MS/MS. Le curve standard sono state disegnate utilizzando diluizioni seriali di una miscela contenente tutti i nucleosidi.I risultati della cromatografia liquida metodo MS/MS sono mostrati qui. Il metodo consente la separazione e la quantificazione delle quattro normali basi di DNA, così come delle quattro basi di citosina modificate. In questa procedura sperimentale, descriviamo la clonazione di dominio catalitico tet2 umano senza ostazioni utilizzando la tecnica di ricombinazione specifica del sito e un'espressione sufficiente in un vettore di destinazione in E.Coli.Abbiamo purificato in modo efficiente l'enzima TET2 non registrato utilizzando la cromatografia a scambio di cationi per produrre una purezza superiore al 90% in un unico passaggio. Inoltre, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di cromatografia liquida per separare le quattro normali basi di DNA e le quattro basi di citosina modificate. Per quantificare gli otto nucleosidi delle reazioni catalizzate da TET2, abbiamo accoppiato il nostro metodo di cromatografia liquida migliorato con la spettrometria di massa tandem.Il saggio sensibile LC-MS/MS è stato quindi utilizzato per determinare l'attività dell'enzima TET2 umano non appiccato ricombinante. L'approccio qui descritto migliorerà notevolmente la valutazione della tet2 diossigenasi di tipo selvatico e mutante.

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