Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

米国国防総省のアイデア賞を受賞 (W81XWH-13-1-0174)、再生不良性貧血と MDS の基盤助成金の形で資金が供給されたこの研究と UMRB MM の作者に許可感謝モヒト Jaiswal し Subhradeep バール pDEST14 ベクトル型 TET2 の初期クローニングのため。

1. クローン作成およびタグなし人間型 TET2 ジオキシゲナーゼの浄化
<ol><li>上記22として部位特異的組換え技術を用いた pDEST14 キャスト先のベクトルに人間型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 年、Δ1481-1843) を複製します。 注: 以前の研究は最小限の触媒活性ドメイン21,23である C ターミナル型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 ...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. 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J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

TET2 遺伝子の変異は、多様な造血器悪性腫瘍患者で最も頻繁に検出された遺伝子の変化の一部です。異なる型 TET2 の変異があり、ナンセンス、フレーム シフト、ミスセンス変異が含まれ、数百日に患者12で識別されています。TET2遺伝子変異を有する患者は、wt 型 TET214とのそれらと比較して骨髄でゲノム 5hmC の低レベルを示します。変異型 TET2?...

CpG のジヌクレオチドのシトシン塩基の C5 の位置は、哺乳類のゲノムの1で優勢なメチル化サイト (5mCpG) です。さらに、多くの最近の研究は広範な C5 シトシンのメチル化 (5mC) 非 CpG サイトを発見した (5mCpH、ところ H = A、T、または C)2,3。5mC 変更は、内在性レトロトランスポゾン遺伝子プロモーター3,4,5で転写サイレンサーとして機能します。5mC のメチル化は、X 染色体不活性化、遺伝子刷り込みや核リプログラミング ティッシュ特定の遺伝子表現5,6,7で重要な役割を果たしています。C5 の位置にシトシンのメチル化は、DNA メチル化酵素により行われ、これらの酵素の突然変異を引き起こす重要な発達の欠陥8。5mC マークの除去は、TET1 3 5mC オキシダーゼ9,10によって開始されます。これらのテト家族 dioxygenases 連続酸化ステップ11,12,13によって 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC に変換します。最後に、チミン DNA グリコシラーゼは 5 fC または未変更のシトシン塩基除去修復経路11を使用する 5caC を置き換えます。
人間型 TET2遺伝子は骨髄異形成症候群 (MDS)14,15,16、MDS 骨髄増殖性腫瘍 (を含む多様な造血器腫瘍における頻繁変異遺伝子として同定されました。MDS-MPN)、およびデータシートとデータシート MPN16由来急性骨髄性白血病 (AML)。5hmC 骨髄 DNA 修飾のレベルは TET2 の突然変異で野生型 (wt) と比較した患者の下に-TET214。グループの数は、その正常造血と骨髄性変換17,18,19,20における役割を明らかにする TET2 ノックアウト マウス モデルを開発しています。TET2 遺伝子に変異を持つマウスが最初通常で実行可能な明らかに多様な造血器腫瘍、高齢、早期死亡の原因が。これらの研究は、正常な造血分化に wt 型 TET2 演じる重要な役割を示した。これらマウス モデル、(TET2± HSCs) ヘテロ接合体の造血幹細胞およびホモ型 TET2-/-の HSCs が両方 TET2+/-として造血系統の再作成でホモ wt TET2 HSCs 上の優位性TET2-/- HSCs は多様な造血器腫瘍17,18を開発しました。これらの研究は、そのハプロ TET2 ジオキシゲナーゼ HSCs の開発を変更し、造血器腫瘍における結果を示しています。
TET2 遺伝子の変異を持つマウスと同様に、ほとんどの白血病患者マニフェスト型 TET2 ジオキシゲナーゼ活性のハプロ。これらの主にヘテロ接合体の体細胞突然変異は、ナンセンス、フレーム シフト突然変異のほとんどがミスセンス突然変異型 TET2 遺伝子体全体に分散ジオキシゲナーゼ ドメイン12でクラスター化します。日には、少し評価 wt と変異 TET2 は TET2 ジオキシゲナーゼとその分析21の生産の難しさによる主に文学で報告されます。ここで、単純なシングル ステップ精製イオン交換クロマトグラフィーを用いたネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼを報告します。さらに、定量的なクロマトグラフィー-タンデム質量分析は最適化され、ネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼの酵素活性を測定するために使用されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

5-メチルシトシン (5mC) を介したエピジェネティックな発現制御は、真核生物の開発で重要な役割を果たしてきました。10-11 転流 dioxygenases (TET1-3)、チミン DNA グリコシラーゼ依存塩基除去修復に続いて連続酸化これらのエピゲノムの脱メチル化を実現します。TET2 遺伝子遺伝子の突然変異によりまたは他のエピジェネティックなメカニズムの不活化は多様な癌、特に造血器腫瘍患者の予後に関連付けられます。ここでは、酵素によって実行中の陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたタグなしの人間型 TET2 ジオキシゲナーゼの効率的な単一ステップ浄化について述べる。さらに別のおよび 4 つの変更されたシトシン塩基 (5-メチル 5-ヒドロキシメチル、5-ホルミルと 5 カルボキシル基) だけでなく、通常の 4 つの DNA 塩基 (A、T、G および C) を定量化できる液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法 (MS/LCMS) アプローチをいたします。この試金は、野生型と変異型 TET2 dioxygenases の活性を評価する使用できます。

テト家族 dioxygenases による DNA の 5mC の動的な変更は、エピジェネティックな転写で重要な役割を果たしています。TET2 ジオキシゲナーゼ頻繁様々 な造血器腫瘍12で変異します。正常な発達と病気 TET2 酵素の役割を調べるためには、pDEST14 ベクトル22に任意の親和性タグなしその最小限の触媒活性ドメインをクローンします。タグの付?...

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Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

ここで、紹介タグの付いていない人間の活動の効率的な単一ステップ浄化のためのプロトコル 10 11 転流 2 (TET2) イオン交換クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィー-タンデム質量を使用しての試金を使用して 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼ分析 (クロマトグラフィー-タンデム質量)-ベースのアプローチ。

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

この方法は、正常および臨床的なTET2突然変異の活性の分析のようなエピジェネティクスおよびTET2媒介した5-メチルシトシン脱メチル化分野における主要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ネイティブTET2を一段階で精製することができ、その活性は、すべての3つの製品の形成の観点から分析することができるということです。数人の大学院生がこの手続きをデモンストレーションします。タンパク質の精製は、チャヤン・バタタリヤ、アニンダ・サンデー・デイによるTET2アッセイ、ナビッド・アヨンによるLC-MS/MS分析によって行われます。細菌変換のために、1.7ミリリットルチューブ内の化学的に有能な大腸菌BL21 DE3細胞の100マイクロリットルにタグなしヒトTET2ジオキシゲナーゼを含む組換えpDEST 14終点発現ベクターを1マイクロリットル加えます。氷上で少なくとも15分間インキュベーションした後、水浴で30秒間摂氏42度で熱ショックを受ける。ヒートショックの直後に、細胞を氷の上に2分間置きます。これに続いて、細胞にカタボライト抑制と超最適なスープの250マイクロリットルを追加します。シェーカーで37°Cで1時間細菌細胞をインキュベートします。インキュベーション後、チューブを9,000倍の重力で1分間遠心して細胞を回転させます。ピペット処理により上清の70%を廃棄し、残りの培地にペレットを溶解する。1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含むリルアスープ寒天プレート上に細胞懸濁液を広げます。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。1つの孤立したコロニーを選択し、LBアンピシリン培地の10ミリリットルにそれを接種する。一晩シェーカーで摂氏37度でチューブをインキュベートします。これに続いて、100マイクロリットルの細菌培養液を使用して、100ミリリットルのLBアンピシリン培地を一次培養物として接種する。一晩シェーカーで摂氏37度でチューブをインキュベートします。翌日、15個のフラスコを接種し、それぞれ600ミリリットルのLBアンピシリン培地を含み、フラスコ当たり6ミリリットルの一次培養液を含有する。180 RPMのシェーカーで37°Cでフラスコをインキュベートします。細菌培養の密度を確認するには、分光光度計を使用して、600ナノメートル(OD600)で光学密度を測定します。培養がOD600で0.8の密度に達した後、各フラスコに1モルIPTGの300マイクロリットルでTET2タンパク質の発現を誘導し、さらに17°Cで培養を16時間培養する。インキュベーションに続いて、細菌培養物を遠心分離機ボトルに移す。遠心分離機は、TET2酵素を5で発現する細菌培養物を、45分間重力の250倍にする。TET2精製用の細菌ペレットを使用してください。氷または摂氏4度で作業し、細菌ペレットを50ミリモルMESバッファーの100ミリリットル、pH 6に再懸濁させる。その後、細胞懸濁液を5ミリリットル服用し、バッファーで45ミリリットルにします。サスペンションをパワー20で30秒間5回、60秒の冷却間隔で超音波処理します。5、250倍の重力で45分間回転させます。可溶性TET2酵素を含む上清を収集し、FPLCシステムにロードする前に0.45ミクロンフィルターを通過させます。30ミリリットルの強いカチネーション交換樹脂をFPLCカラムに詰めます。FPLCシステムを使用して、1分間0.3ミリリットルの一定の流量で10床の洗浄バッファーでカラムを平衡化します。明確化したライセートを事前平衡カラムに積み込み、フロースルーが明らかになるまで約10床の洗浄バッファで洗浄します。15床の容積の洗浄緩衝液から溶出バッファーへのゼロから10%の勾配を使用してElute TET2、2つのベッド容積のための10%溶出緩衝液での保持が続く。カラムローディング前後の細胞溶解物の100マイクロリットルサンプルを、すべての溶出画分と共に収集し、10%解決SDS-PAGEゲルで分析します。TET2タンパク質を含む分画をプールし、タンパク質を凍結乾燥させる。その後、10ミリリットルの水に酵素を溶解し、マイナス80度で保存します。3マイクログラムの基質を用いて三重化中のすべての脱メチル化反応を行います。精製されたTET2酵素の100マイクログラムを総反応バッファーの50マイクロリットルに加えます。37度で1時間のインキュベーションの後、500ミリモルEDTAの5マイクロリットルでTET2触媒酸化反応をクエンチ。分析用のサンプルを調製するために、最初に55マイクロリットルのクエンチ反応にオリゴ結合バッファーの100マイクロリットルを加えることによってTET2反応混合物からDNAを分離する。これに続いて、混合物に100%エタノールの400マイクロリットルを加える。この混合物をオリゴ結合列に通します。結合したDNAを750マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄した後、20マイクロリットルの水でDNAを溶出させる。今度は、DNase Iの2単位と摂氏37度のS1ヌクレアーゼの60単位で単離されたDNAを12時間消化し、個々のヌクレオシド一リン酸を生成する。消化後、サンプルに2単位の子牛腸管アルカリホスファターゼを加える。37°Cで12時間加えて、ヌクレオシド一リン酸から末端リン酸基を除去し、ヌクレオシドを得る。LC-MS/MS法の開発のために、すべての修飾シトシンヌクレオシドの100マイクロモルストック溶液と、HPLCグレードの水中の正常なDNA塩基を調製します。拡張 MS スキャン モードで 1 分間に 10 マイクロリットルの流量で質量分析計にストックソリューションを 1 つずつ注入することにより、ヌクレオシド依存 MS/MS パラメータを最適化します。いくつかのパラメータは、各DNAヌクレオシドのソフトウェアの自動定量最適化機能を使用して最適化することができます。この時点で、フローインジェクション解析モードのソフトウェアの手動定量的最適化機能を使用して、DNAヌクレオシドごとに残りのパラメータを最適化します。現在では、1分間に0.3ミリリットルの流量で25%の溶媒Bの勾配を使用して10マイクロリットルのストック溶液を注入することで、ソース依存MS/MSパラメータを最適化します。8つのDNAヌクレオシドをすべて分離するには、C18カラムのテキストプロトコルに詳述されているように液体クロマトグラフィーを実行します。最後に、LC-MS/MS法を標準曲線で使用して、全てのヌクレオシドを検出し、定量化します。TET2の触媒ドメインは、ほとんどの先住民族の大腸菌タンパク質と比較して比較的高い等電点を有するため、カチオン交換クロマトグラフィーを利用した効率的な精製プロセスが開発された。この精製は、単一のステップで90%以上の純粋なTET2酵素を生み出した。異なるデオキシシチジン誘導体とTET2酵素反応に続く4つの天然DNA塩基を分離および定量化するために、感度の高いLC-MS/MSベースのアッセイを最適化しました。標準曲線は、全てのヌクレオシドを含む混合物の連続希釈を用いて描かれた。液体クロマトグラフィー MS/MS 法の結果を以下に示します。この方法は、4つの正常DNA塩基と、4つの修飾されたシトシン塩基の分離および定量化を可能にする。本実験手順では、部位特異的組換え技術を用いたタグなしヒトTET2ジオキシナーゼ触媒ドメインのクローニングと、大腸菌における標的ベクターにおける十分な発現について説明する。カチ換算クロマトグラフィーを利用したタグなしTET2酵素を効率よく精製し、1回の工程で90%以上の純度を得た。また、4つの正常DNA塩基と4つの修飾シトシン塩基を分離する新規液体クロマトグラフィー法を開発しました。TET2触媒反応から8つのヌクレオシドを定量化するために、改善された液体クロマトグラフィー法とタンデム質量分析法を組み合わせた。その後、感受性LC-MS/MSアッセイを利用して、組み換え非タグ化ヒトTET2酵素の活性を決定した。ここで説明するアプローチは、野生型および変異型TET2ジオキシゲナーゼの評価を大幅に高める。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

示差走査熱量測定 - タンパク質抗原の熱安定性および立体配座を評価するための方法

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

ガングリオシドの抽出、精製、プロファイリング

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

内因性 ショウジョウバエ 一過性受容器電位チャネルの精製

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

10-11 転流 2 5-メチルシトシンジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製