Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av det amerikanske forsvarsdepartementet i form av en idé Award (W81XWH-13-1-0174), aplastisk anemi og MDS stiftelse stipend, og UMRB grant mm Authors takke Mohit Jaiswal og Subhradeep Bhar for første kloning av TET2 i pDEST14 vektor.

1. kloning og rensing av ukodede menneskelig TET2 Dioxygenase
<ol><li>Klone menneskelig TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) i pDEST14 destinasjon vektor med områdespesifikke rekombinasjon teknikk som beskrevet tidligere22. Merk: Tidligere studier har vist at C-terminalen TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) domenet er minimal katalytisk aktive domene21,23. For å uttrykke ukodede TET2 dioxygenase domenet bruker p...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain.">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development.">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li><li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development.">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li><li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids.">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

Mutasjoner i genet TET2 er noen av de oftest har oppdaget genetiske endringene i pasienter med ulike blodkreft malignancies. Hittil hundrevis av forskjellige TET2 mutasjoner, som inkluderer tull, ramme-shift og eks. missense mutasjoner, har blitt identifisert i pasienter12. Pasienter med TET2 mutasjoner viser lave nivåer av genomic 5hmC i beinmargen sammenlignet med de med wt-TET214. Mutant TET2 bank i eksperimenter har recapitulated effekten av disse mut...

C5 plasseringen av cytosine baser innenfor CpG dinucleotides er den dominerende metylering nettstedet (5mCpG) i pattedyr genomer1. I tillegg en rekke studier har avdekket omfattende C5 cytosine metylering (5mC) i ikke-CpG nettsteder (5mCpH, hvor H = A, T, eller C)2,3. 5mC endring fungerer som transcriptional lyddemper på endogene retrotransposons og gene arrangører3,4,5. DNA metylering på 5mC spiller også viktige roller i X-kromosom inaktivering, gene preging, kjernefysiske omprogrammering og vev-spesifikke genet uttrykk5,6,7. Metylering av cytosine C5 der utføres av DNA methyltransferases og mutasjoner i disse enzymene forårsake betydelige utviklingsmessige defekter8. Fjerning av 5mC merker er initiert av TET1-3 5mC oxidases9,10. Disse TET-serien dioxygenases konvertere 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) av sekvensiell oksidasjon trinn11,12,13. Endelig erstatter thymine-DNA glycosylase 5fC eller 5caC til uforandret cytosine ved hjelp av base excision repair pathway11.
Menneskelige TET2 genet ble identifisert som en ofte muterte genet i ulike blodkreft malignitet inkludert AML syndromer (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferative neoplasms ( MDS-MPN), og akutt myelogen leukemi (AML) fra MDS og MDS-MPN16. 5hmC endring i beinmargen DNA er lavere hos pasienter med TET2 mutasjoner sammenlignet med vill-type (wt)-TET214. Flere grupper har utviklet TET2-knockout musen modeller for å belyse sin rolle i normal hematopoiesis og myelogen transformasjon17,18,19,20. Disse musene mutasjoner i genet TET2 var opprinnelig normal og levedyktig, men manifestert mangfoldig blodkreft malignitet som de alderen forårsaker deres tidlig død. Disse studiene viste de viktige rollene spilt av wt-TET2 i normal blodkreft differensiering. I disse musen modeller, heterozygote blodkreft stamceller (TET2+ / HSCs) og homozygous TET2- / - hadde HSCs et konkurransefortrinn over homozygous wt-TET2 HSCs i repopulating blodkreft linjene som begge TET2+/- og TET2- / - HSCs utviklet mangfoldig blodkreft malignitet17,18. Disse studiene viser at haploinsufficiency av TET2 dioxygenase endrer utviklingen av HSCs og resultater i blodkreft malignancies.
Ligner mus mutasjoner i genet TET2, de fleste leukemi pasienter manifestere haploinsufficiency TET2 dioxygenase aktivitet. Disse meste heterozygote somatiske mutasjoner omfatter ramme-shift og tull mutasjoner spredt over hele TET2 gene kroppen mens eks. missense mutasjoner som er mest i den dioxygenase domene12. Hittil er lite karakterisering av wt - og mutant-TET2 rapportert i litteraturen skyldes problemer med produksjon av TET2 dioxygenase og sine analysen21. Her rapporterer vi et enkelt enkeltsteg rensing av innfødte TET2 dioxygenase bruker ionebytte kromatografi. Videre var en kvantitativ LC--MS-/ MS analysen optimalisert og brukes til å måle den enzymatiske aktiviteten av innfødte TET2 dioxygenase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

Epigenetic transkripsjon regulering formidlet av 5-methylcytosine (5mC) har spilt en avgjørende rolle i eukaryote utvikling. Demethylation disse epigenetic merkene oppnås ved sekvensiell oksidasjon av ti-elleve translokasjon dioxygenases (TET1-3), etterfulgt av thymine-DNA glycosylase-avhengige base excision reparasjon. Inaktivering av TET2 genet genetiske mutasjoner eller av andre epigenetic mekanismer er forbundet med en dårlig prognose hos pasienter med ulike kreftformer, spesielt blodkreft malignancies. Her beskriver vi en effektiv enkeltsteg rensing av enzymatisk aktive ukodede menneskelig TET2 dioxygenase bruker cation exchange kromatografi. Videre tilbyr vi en flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) tilnærming som kan skille og kvantifisere fire vanlige DNA baser (A, T, G og C), samt fire modifisert cytosine baser (5-metyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, og 5-carboxyl). Denne analysen kan brukes til å evaluere vill type og mutant TET2 dioxygenases.

Dynamisk endring av 5mC i DNA av TET-serien dioxygenases spiller viktige roller i epigenetic transcriptional forskrifter. TET2 dioxygenase er ofte mutert i ulike blodkreft malignitet12. Undersøke rollen av TET2 enzym i normal utvikling og sykdom, har vi klonet sitt minimale katalytisk aktive domene uten noen affinitet tag inn pDEST14 vektor22. Den ukodede TET2 dioxygenase ble produsert på ∼5% av det totale løselig proteinet av SDS side ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Her presenterer vi en protokoll for en effektiv enkeltsteg rensing av den aktive ukodede menneskelige ti-elleve translokasjon-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase ion-exchange kromatografi og dens analysen med en flytende kromatografi-tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS)-tilnærming.

Effektiv rensing og LC-MS/MS-baserte analysen utvikling for ti-elleve translokasjon-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i epigenetikk og TET2 mediert 5-Metylcytosin demetylering felt en slik analyse av aktivitet av normale og kliniske TET2 mutasjoner. Den største fordelen med denne teknikken er at innfødt TET2 kan renses i ett enkelt trinn, og aktiviteten kan analyseres når det gjelder dannelse av alle tre produktene. Flere nyutdannede studenter vil demonstrere prosedyren.Proteinrensingen vil bli utført av Chayan Bhattacharya, TET2-analysen av Aninda Sundary Dey og LC-MS/MS-analysen av Navid Ayon. For bakteriell transformasjon, tilsett en mikroliter rekombinant pDEST 14 destinasjonsuttrykkvektor som inneholder ukodede humane TET2 dioksygenase til 100 mikroliter kjemisk kompetente E.coli BL21 DE3-celler i et 1,7 milliliter rør. Etter inkubasjon på is i minst 15 minutter, varmesjokk blandingen på 42 grader Celsius i 30 sekunder i et vannbad.Umiddelbart etter varmesjokk, legg cellene tilbake på is i minst to minutter. Etter dette, legge til 250 mikroliter super optimal kjøttkraft med katabolitt undertrykkelse til celler. Inkuber bakteriecellene i en time ved 37 grader Celsius i en shaker.Etter inkubasjon, spinn ned cellene ved å sentrifugere røret på 9000 ganger tyngdekraften i ett minutt. Kast 70% av det overnaturlige ved pipettering, og oppløs pelleten i de resterende mediene. Spre celle suspensjon på en Lirua kjøttkraft agar plate som inneholder 100 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkuber platen i 16 timer ved 37 grader Celsius. Velg en isolert koloni, og inokuler den i 10 milliliter LB ampicillin media. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i en shaker over natten.Etter dette, bruk 100 mikroliter bakteriell kultur for å inokulere 100 milliliter LB ampicillin media som en primær kultur. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i en shaker over natten. Neste dag, inokulere 15 flasker, hver inneholder 600 milliliter LB ampicillin media med seks milliliter primær kultur per kolbe.Inkuber kolben ved 37 grader Celsius på en shaker ved 180 RPM. For å sjekke tettheten av bakteriekulturen, mål den optiske tettheten på 600 nanometer, eller OD600, ved hjelp av et spektrofotometer. Etter at kulturen når en tetthet på 0,8 ved OD600, induserer uttrykket av TET2-protein med 300 mikroliter av en molar IPTG i hver kolbe, og vokser kulturen i ytterligere 16 timer ved 17 grader Celsius.Etter inkubasjon, overfør bakteriekulturen til sentrifugeflasker. Sentrifuger bakteriekulturen som uttrykker TET2-enzymet ved 5, 250 ganger tyngdekraften i 45 minutter. Bruk bakteriell pellet for TET2 rensing.Arbeider på is eller ved fire grader Celsius, re-suspendere bakteriell pellet i 100 milliliter av 50-millimolar MES buffer, pH seks. Ta deretter fem milliliter av cellesuspensjonen, og ta den til 45 milliliter med bufferen. Sonicate suspensjonen i fem ganger 30 sekunder ved strøm 20, med 60-sekunders kjøleintervaller.Spinn lysatet på 5, 250 ganger tyngdekraften i 45 minutter. Samle supernatanten som inneholder det oppløselige TET2-enzymet, og send det gjennom 0,45 mikronfiltre før du laster på et FPLC-system. Pakk 30 milliliter med en sterk kation utveksling harpiks i en FPLC-kolonne.Likevekt kolonnen med 10 sengevolumer vaskebuffer med konstant strømningshastighet på 0,3 milliliter per minutt ved hjelp av et FPLC-system. Legg det avklarede lysatet på den forhåndsutjevnede kolonnen, og vask med ca. 10 sengevolumer vaskebuffer til gjennomstrømningen blir klar. Elute TET2 ved hjelp av en null til 10% gradering fra vaskebufferen til elutionbufferen i 15 sengevolumer, etterfulgt av en hold på 10% elution buffer for to sengevolumer.Samle 100 mikrolitersprøver av cellelylat før og etter kolonnelasting, sammen med alle elution-brøkene, og analyser på 10% løse SDS-PAGE gel. Pool brøkene som inneholder TET2 protein, og fryse-tørke proteinet. Oppløs deretter enzymet i 10 milliliter vann, og lagre ved minus 80 grader Celsius.Utfør alle demetyleringsreaksjoner i triplikate med tre mikrogram substrat. Tilsett 100 mikrogram renset TET2-enzym til 50 mikroliter total reaksjonsbuffer. Etter en time inkubasjon ved 37 grader slukker du TET2 katalyserte oksidasjonsreaksjoner med fem mikroliter på 500 millimolar EDTA.For å forberede prøver for analyse, skille DNA fra TET2 reaksjonsblandingen ved først å legge til 100 mikroliter oligo bindingsbuffer til 55 mikroliter av slukket reaksjon. Etter dette legger du til 400 mikroliter med 100% etanol til blandingen. Send denne blandingen gjennom en Oligo bindingskolonne.Etter å ha vasket det bundne DNA med 750 mikroliter vaskebuffer, elute DNA i 20 mikroliter vann. Nå fordøye det isolerte DNA med to enheter av DNase I og 60 enheter av S1 kjerner ved 37 grader Celsius i 12 timer for å produsere individuelle nukleosidmonosfater. Etter fordøyelsen, legg til to enheter av kalv intestinal alkalisk fosfatase til prøvene.Inkuber i tillegg 12 timer ved 37 grader Celsius for å fjerne terminalfosfatgruppene fra nukleosidmonofosfatene, og få nukleosider. Forbered en 100 mikromolar lagerløsning av alle modifiserte cytosinkjerner, og de normale DNA-basene i HPLC-graders vann for utvikling av LC-MS/MS-metoden. Optimaliser de nukleosidavhengige MS/MS-parametrene ved å infusere lagerløsninger én om gangen i massespektrometeret med en strømningshastighet på 10 mikroliter per minutt i forbedret MS-skannemodus.Flere parametere kan optimaliseres ved hjelp av den automatiserte kvantitative optimaliseringsfunksjonen i programvaren for hver DNA-kjerne. På dette punktet, optimalisere de gjenværende parametrene for hver DNA-kjerne ved hjelp av den manuelle kvantitative optimaliseringsfunksjonen i programvaren i flytinjeksjonsanalysemodus. Nå optimaliserer du kildeavhengige MS/MS-parametere ved å injisere 10 mikroliter lagerløsning ved hjelp av en gradering med 25 % løsningsmiddel B med en strømningshastighet på 0,3 milliliter per minutt.For å skille alle åtte DNA-nukleossider, utfør flytende kromatografi som beskrevet i tekstprotokollen på en C18-kolonne. Til slutt kan du oppdage og kvantifisere alle nukleosider ved hjelp av LC-MS/MS-metoden i standardkurver. Siden det katalytiske domenet til TET2 har et relativt høyt isoelektrisk punkt sammenlignet med de fleste innfødte E.coli-proteiner, ble det utviklet en effektiv renseprosess ved hjelp av kationutvekslingskromatografi.Denne rensingen ga større enn 90% rent TET2-enzym i ett enkelt trinn. For å skille og kvantifisere ulike deoksycytidinderivater og de fire naturlige DNA-basene etter TET2 enzymatisk reaksjon, ble en sensitiv LC-MS/MS-basert analyse optimalisert. Standardkurver ble trukket ved hjelp av seriefortynninger av en blanding som inneholder alle nukleosider.Resultatene av den flytende kromatografiEN MS/MS-metoden vises her. Metoden muliggjør separasjon og kvantifisering av de fire normale DNA-basene, samt de fire modifiserte cytosinbasene. I denne eksperimentelle prosedyren beskriver vi kloningen av ukodet humant TET2 dioksynasekatalytisk domene ved hjelp av stedsspesifikk rekombinasjonsteknikk og et tilstrekkelig uttrykk i en målvektor i E.Coli.Vi renset effektivt ukodet TET2-enzym ved hjelp av kationutvekslingskromatografi for å gi større enn 90 % renhet i ett enkelt trinn. Videre har vi utviklet en ny flytende kromatografimetode for å skille de fire normale DNA-basene og de fire modifiserte cytosinbasene. For å kvantifisere de åtte nukleosider fra TET2 katalyserte reaksjoner, har vi kombinert vår forbedrede flytende kromatografimetode med tandemmassespektrometri.Den følsomme LC-MS/MS-analysen ble deretter brukt til å bestemme aktiviteten til rekombinant ukodet humant TET2-enzym. Tilnærmingen beskrevet her vil i stor grad forbedre verdsettelsen av villtype og mutert TET2 dioksygenase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilnærming for produksjon av Reversibel disulfide tverrbundet Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry - En metode for å vurdere termisk stabilitet og konformasjon av Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ganglioside utvinning, rensing og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Rensing av endogene Drosophila transiente reseptorpotensialkanaler

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...