Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Esta investigación fue financiada por el Departamento de defensa en la forma de un premio de Idea (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplásica y subvención de la Fundación de MDS, y concesión UMRB a Authors M.M. gracias Mohit Jaiswal y Subhradeep Bhar para clonación inicial de TET2 en vector de pDEST14.

1. clonación y purificación del Dioxygenase TET2 humano sin etiquetar
<ol><li>Clon humano TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) en el vector de destino de pDEST14 utilizando la técnica de recombinación específica del sitio como se describió anteriormente22. Nota: Estudios previos han demostrado que el dominio C-terminal TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) es el dominio catalítico activo mínimo21,23. Para ex...

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	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

Las mutaciones en el gen TET2 son algunos de los cambios genéticos más frecuentemente detectados en pacientes con malignidades hematopoyéticas diversos. Hasta la fecha cientos de mutaciones diferentes de TET2, que incluyen el cambio del marco y absurdo y mutaciones sin sentido, se han identificado en pacientes12. Pacientes con mutaciones TET2 muestran niveles bajos de 5hmC genómica en la médula ósea en comparación con aquellos con TET2 wt14. TET2 mu...

La posición C5 de bases de citosina en los dinucleótidos CpG es el sitio predominante de metilación (5mCpG) en genomas mamíferos1. Además, varios estudios recientes han descubierto extensa metilación de citosina de C5 (5mC) en sitios de CpG no (5mCpH, donde H = A, T, o C)2,3. modificación de la 5mC sirve como un silencioso transcripcional en retrotransposones endógeno y genes promotores3,4,5. La metilación del ADN en 5mC también juega un papel importante en la inactivación del cromosoma X, impresión de gene, reprogramación nuclear y expresión de genes específicos de tejido5,6,7. Metilación de la citosina en la posición C5 se lleva a cabo por las ADN metiltransferasas, y las mutaciones en estas enzimas causan defectos de desarrollo significativo8. La eliminación de las marcas de 5mC iniciada por TET1-3 5mC oxidasas9,10. Estos dioxygenases de TET-familia convertir 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC) por oxidación secuencial pasos11,12,13. Finalmente, reemplaza a timina ADN glicosilasa fC 5 o 5caC de citosina no modificado usando la base de la supresión reparación vía11.
El gene humano de TET2 fue identificado como un gen mutado con frecuencia en diversas neoplasias hematopoyéticas incluyendo myelodysplastic (MDS) los síndromes14,15,16, (neoplasias mieloproliferativas MDS MDS-MPN) y la leucemia mieloide aguda (AML) originarios del MDS y MDS-MPN16. Los niveles de modificación de 5hmC en la médula ósea ADN son menores en pacientes con mutaciones TET2 comparadas con aquellos con el tipo salvaje (wt)-TET214. Varios grupos han desarrollado modelos de ratón knockout TET2 para aclarar su papel en la hematopoyesis normal y transformación mieloide17,18,19,20. Estos ratones con mutaciones en el gen TET2 fueron inicialmente normal y viable, pero se manifiesta diversas malignidades hematopoyéticas como ellos de años causando su temprana muerte. Estos estudios demostraron el importante papel desempeñado por la wt TET2 en diferenciación Hematopoyética normal. En estos modelos de ratón, las células madre hematopoyéticas heterozigóticas (TET2+- HSCs) y homocigótica TET2- / - HSCs tenían una ventaja competitiva sobre homocigotos wt-TET2 HSCs en repoblación linajes hematopoyéticos como ambos TET2+- y TET2- / - HSCs desarrolló diversas malignidades hematopoyéticas17,18. Estos estudios demuestran el haploinsufficiency de TET2 dioxygenase altera el desarrollo de HSCs y resultados de las malignidades hematopoyéticas.
Similar a los ratones con mutaciones en el gen TET2, la mayoría de pacientes con leucemia manifiestan haploinsufficiency de TET2 dioxygenase actividad. Estas mutaciones somáticas principalmente heterozigóticas incluyen mutaciones de cambio del marco y absurdo dispersadas por todo el cuerpo de gene TET2 mientras que las mutaciones sin sentido que están más agrupados en el dioxygenase dominio12. Hasta la fecha, poca caracterización de wt y mutante TET2 es divulgado en la literatura principalmente debido a las dificultades con la producción de TET2 dioxigenasa y su ensayo21. Aquí, Divulgamos una simple purificación solo paso de nativo dioxygenase TET2 mediante cromatografía de intercambio iónico. Además, un ensayo LC-MS/MS fue optimizado y utilizado para medir la actividad enzimática del dioxygenase TET2 nativo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

La regulación epigenética de la transcripción mediada por la 5-METILCITOSINA (5mC) ha desempeñado un papel crítico en el desarrollo de eucariota. Desmetilación de estas marcas epigenéticas se logra por oxidación secuencial de diez-once desplazamiento dioxygenases (TET1-3), seguido de la timina ADN glicosilasa dependiente supresión base reparación. Inactivación del gen TET2 debido a mutaciones genéticas o por otros mecanismos epigenéticos se asocia con un pronóstico pobre en pacientes con diversos tipos de cáncer, especialmente de malignidades hematopoyéticas. Aquí, describimos una purificación eficiente solo paso de enzimáticamente activa sin etiquetar dioxigenasa de TET2 humana usando la cromatografía de intercambio catiónico. Además ofrecemos un enfoque líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que se puede separar y cuantificar las cuatro bases del ADN normales (A, T, G y C), así como de las cuatro bases de citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, 5-formil y 5-carboxilo). Este ensayo puede utilizarse para evaluar la actividad de tipo salvaje y mutante TET2 dioxygenases.

Modificación dinámica de 5mC en ADN por TET-familia dioxygenases juega un papel importante en las regulaciones transcripcionales epigenéticas. Dioxygenase TET2 es transformado con frecuencia en diversas malignidades hematopoyéticas12. Para investigar el papel de la enzima TET2 en desarrollo normal y la enfermedad, hemos clonado su dominio catalítico activo mínimo sin ninguna etiqueta de afinidad en el vector de pDEST1422. El dioxygenas...

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Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Aquí, presentamos un protocolo para una purificación eficiente solo paso del humano sin etiquetar activo desplazamiento de diez-once-2 (TET2) 5-METILCITOSINA dioxygenase utilizando cromatografía de intercambio iónico y su ensayo con una masa líquida de la cromatografía-tandem Espectrometría (LC-MS/MS)-enfoque basado en.

Eficiente purificación y desarrollo análisis LC-MS/MS-based para diez-once 2 desplazamiento 5-METILCITOSINA dioxigenasa

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en epigenética y TET2 mediado 5-Methylcytosine demethylation field tales análisis de la actividad de mutaciones tet2 normales y clínicas. La principal ventaja de esta técnica es que el TET2 nativo se puede purificar en un solo paso, y su actividad se puede analizar en términos de formación de los tres productos. Varios estudiantes graduados demostrarán el procedimiento.La purificación de proteínas será realizada por Chayan Bhattacharya, el ensayo TET2 de Aninda Sundary Dey y el análisis LC-MS/MS de Navid Ayon. Para la transformación bacteriana, añada un microlitro de vector de expresión de destino pDEST 14 recombinante que contenga dioxigenasa TET2 humana sin etiquetar a 100 microlitros de células E.coli BL21 DE3 químicamente competentes en un tubo de 1,7 mililitros. Después de la incubación en hielo durante al menos 15 minutos, impacte térmicamente la mezcla a 42 grados Celsius durante 30 segundos en un baño de agua.Inmediatamente después del choque de calor, vuelva a colocar las células sobre hielo durante un mínimo de dos minutos. Después de esto, añadir 250 microlitros de caldo súper óptimo con represión catabolita a las células. Incubar las células bacterianas durante una hora a 37 grados centígrados en una coctelera.Después de la incubación, gire hacia abajo las células centrifugando el tubo a 9.000 veces la gravedad durante un minuto. Deseche el 70% del sobrenadante por pipeteo, y disuelva el pellet en el medio restante. Extienda la suspensión celular sobre una placa de agar de caldo de Lirua que contenga 100 microgramos por mililitro ampicilina.Incubar la placa durante 16 horas a 37 grados centígrados. Seleccione una colonia aislada e inocularla en 10 mililitros de medios de ampicilina LB. Incubar el tubo a 37 grados centígrados en una coctelera durante la noche.Después de esto, utilizar 100 microlitros de cultivo bacteriano para inocular 100 mililitros de medios de ampicilina LB como un cultivo primario. Incubar el tubo a 37 grados centígrados en una coctelera durante la noche. Al día siguiente, inocular 15 matraces, cada uno con 600 mililitros de medios de ampicilina LB con seis mililitros de cultivo primario por matraz.Incubar los matraces a 37 grados centígrados en una coctelera a 180 RPM. Para comprobar la densidad del cultivo bacteriano, mida su densidad óptica a 600 nanómetros, o OD600, utilizando un espectrofotómetro. Después de que el cultivo alcance una densidad de 0,8 en OD600, induzca la expresión de la proteína TET2 con 300 microlitros de un IPTG molar en cada matraz, y haga crecer el cultivo durante 16 horas adicionales a 17 grados centígrados.Después de la incubación, transferir el cultivo bacteriano a botellas centrífugas. Centrifugar el cultivo bacteriano expresando la enzima TET2 a 5, 250 veces la gravedad durante 45 minutos. Utilice el pellet bacteriano para la purificación de TET2.Trabajando en hielo o a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 100 mililitros de tampón MES de 50 mililitros, pH seis. Luego tome cinco mililitros de la suspensión celular, y llevarlo a 45 mililitros con el buffer. Sonicar la suspensión durante cinco veces 30 segundos a potencia 20, con intervalos de enfriamiento de 60 segundos.Gire el izado a 5, 250 veces la gravedad durante 45 minutos. Recoger el sobrenadante que contiene la enzima TET2 soluble y pasarlo a través de filtros de 0,45 micras antes de cargar en un sistema FPLC. Empaquete 30 mililitros de una resina de intercambio catiónica fuerte en una columna FPLC.Equilibre la columna con 10 volúmenes de lecho de tampón de lavado a un caudal constante de 0,3 mililitros por minuto utilizando un sistema FPLC. Cargue el izado clarificado en la columna preequilibrada y lave con aproximadamente 10 volúmenes de lecho de tampón de lavado hasta que el flujo se vuelva claro. Elute TET2 usando un gradiente de cero a 10% desde el búfer de lavado hasta el búfer de elución en 15 volúmenes de lecho, seguido de una retención en un búfer de elución del 10% para dos volúmenes de lecho.Recoger 100 muestras de microlitro de analizo celular antes y después de la carga de la columna, junto con todas las fracciones de elución, y analizar en 10%resolviendo gel SDS-PAGE. Agrupa las fracciones que contienen proteína TET2 y seca la proteína. Luego disuelve la enzima en 10 mililitros de agua, y guárdalos a menos 80 grados Centígrados.Realizar todas las reacciones de desmetilación en triplicado con tres microgramos de sustrato. Añadir 100 microgramos de enzima TET2 purificada a 50 microlitros de tampón de reacción total. Después de una hora de incubación a 37 grados, apagar las reacciones de oxidación catalizadas TET2 con cinco microlitros de EDTA de 500 milímetros.Para preparar muestras para el análisis, separe el ADN de la mezcla de reacción TET2 añadiendo primero 100 microlitros de tampón de unión Oligo a 55 microlitros de reacción apagada. Después de esto, añadir 400 microlitros de 100% etanol a la mezcla. Pase esta mezcla a través de una columna de enlace Oligo.Después de lavar el ADN enlazado con 750 microlitros de tampón de lavado, eluir el ADN en 20 microlitros de agua. Ahora, digiere el ADN aislado con dos unidades de DNase I y 60 unidades de nucleasa S1 a 37 grados Celsius durante 12 horas para producir monofosfatos de nucleósidos individuales. Después de la digestión, añadir dos unidades de fosfatasa alcalina intestinal de la pantorrilla a las muestras.Incubar por una adición 12 horas a 37 grados Celsius para eliminar los grupos de fosfato terminal de los monofosfatos de nucleósidos, y obtener los nucleósidos. Preparar una solución de stock de 100 micromolares de todos los nucleósidos de citosina modificados, y las bases de ADN normales en agua de grado HPLC para el desarrollo del método LC-MS/MS. Optimice los parámetros de MS/MS dependientes de nucleósidos mediante la infusión de soluciones de stock de una en una en el espectrómetro de masas a un caudal de 10 microlitros por minuto en el modo de escaneo de MS mejorado.Se pueden optimizar varios parámetros utilizando la función de optimización cuantitativa automatizada del software para cada nucleósido de ADN. En este punto, optimice los parámetros restantes para cada nucleósido de ADN utilizando la función de optimización cuantitativa manual del software en el modo de análisis de inyección de flujo. Ahora, optimice los parámetros de MS/MS dependientes de la fuente inyectando 10 microlitros de solución de stock utilizando un gradiente con un 25% de disolvente B a un caudal de 0,3 mililitros por minuto.Para separar los ocho nucleósidos de ADN, realice cromatografía líquida como se detalla en el protocolo de texto en una columna C18. Por último, detecte y cuantifique todos los nucleósidos utilizando el método LC-MS/MS en curvas estándar. Dado que el dominio catalítico de TET2 tiene un punto isoeléctrico relativamente alto en comparación con la mayoría de las proteínas E.coli autóctonas, se desarrolló un proceso de purificación eficiente que utiliza una cromatografía de intercambio catiónico.Esta purificación produjo una enzima TET2 superior al 90% pura en un solo paso. Con el fin de separar y cuantificar diferentes derivados de la desoxicimidina y las cuatro bases de ADN naturales que siguen a la reacción enzimática TET2, se optimizó un ensayo sensible basado en LC-MS/MS. Las curvas estándar se dibujaron utilizando diluciones en serie de una mezcla que contiene todos los nucleósidos.Los resultados del método de cromatografía líquida MS/MS se muestran aquí. El método permite la separación y cuantificación de las cuatro bases normales de ADN, así como las cuatro bases de citosina modificadas. En este procedimiento experimental, describimos la clonación de dominio catalítico texoxigenasa TET2 humano sin etiqueta utilizando una técnica de recombinación específica del sitio y una expresión suficiente en un vector de destino en E. Coli.Hemos purificado eficientemente la enzima TET2 sin etiquetar utilizando cromatografía de intercambio catiónica para producir más del 90% de pureza en un solo paso. Además, hemos desarrollado un nuevo método de cromatografía líquida para separar las cuatro bases normales de ADN y las cuatro bases de citosina modificadas. Para cuantificar los ocho nucleósidos de las reacciones catalizadas TET2, hemos acoplado nuestro método mejorado de cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem.A continuación, se utilizó el ensayo sensible LC-MS/MS para determinar la actividad de la enzima TET2 humana recombinante sin etiquetar. El enfoque descrito aquí mejorará en gran medida la valoración de la dioxigenasa TET2 mutante y de tipo salvaje.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

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Investigación

Bioquímica

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