Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Denna forskning har finansierats av US-avdelningen av försvar i form av en Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastisk anemi och MDS Foundation Grant, och UMRB bidrag till M.M. Authors tacka Mohit Jaiswal och Subhradeep Bhar för inledande kloning av TET2 i pDEST14 vektor.

1. kloning och rening av otaggade mänskliga TET2 dioxygenas
<ol><li>Klona mänskliga TET2 dioxygenas (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) i den pDEST14 destination vektor med platsspecifika rekombination teknik som tidigare beskrivits22. Obs: Tidigare studier har visat att C-terminal TET2 dioxygenas (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) domänen är den minimala catalytically aktiv domän21,23. För att uttrycka otaggade TET2 dioxygenas domänen me...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain.">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development.">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li><li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development.">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li><li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids.">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

Mutationer i TET2-genen är några av de vanligaste identifierade genetiska förändringarna hos patienter med varierande hematopoetiska maligniteter. Hittills hundratals olika TET2-mutationer, bland annat nonsens, ram-Skift och missense mutationer, har identifierats i patienter12. Patienter med TET2 mutationer uppvisar låga nivåer av genomisk 5hmC i benmärgen jämfört med dem med wt-TET214. Mutant TET2 inpressning experiment har återgetts effekterna ...

Cytosin baser inom CpG dinucleotides C5 position är den dominerande metylering webbplatsen (5mCpG) i däggdjur genomen1. Dessutom ett antal nyligen genomförda studier har avslöjat omfattande C5 cytosin metylering (5mC) i icke-CpG platser (5mCpH, där H = A, T, eller C)2,3. 5mC modifiering fungerar som transkriptionell ljuddämpare på endogena retrotransposons och gen promotorer3,4,5. DNA-metylering på 5mC också spelar viktiga roller i X-kromosomen inaktivering, gen imprinting, nukleära omprogrammering och vävnadsspecifika gen uttryck5,6,7. Metylering av cytosin vid C5 position utförs av DNA-metyltransferaser och mutationer i dessa enzymer orsaka betydande defekter8. Avlägsnande av 5mC märken initieras av TET1-3 5mC oxidases9,10. Dessa TET-familjen dioxygenases konvertera 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) av sekventiell oxidation steg11,12,13. Slutligen, tymin-DNA glykosylas ersätter 5fC eller 5caC till omodifierade cytosin med base excision repair väg11.
Den mänskliga TET2 -genen identifierades som en ofta muterad gen i olika hematopoietiska maligniteter inklusive myelodysplastiskt syndrom (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferativa neoplasmer ( MDS-MPN), och akut myeloisk leukemi (AML) med ursprung från MDS och MDS-MPN16. Nivåerna av 5hmC ändring i benmärgen DNA är lägre hos patienter med TET2 mutationer jämfört med dem med vildtyp (wt)-TET214. Ett antal grupper har utvecklat TET2-knockout musmodeller för att belysa dess roll i normal blodbildning och myeloisk omvandling17,18,19,20. Dessa möss med mutationer i genen TET2 var initialt normal och lönsamt, men yttrar sig olika hematopoietiska maligniteter som de äldre orsakar deras tidiga död. Dessa studier visade de viktiga roller i wt-TET2 normala hematopoetiska differentiering. I dessa musmodeller, heterozygot hematopoetiska stamceller (TET2+/- Förenta) och homozygot TET2- / - hade Förenta en konkurrensfördel gentemot homozygot wt-TET2 Förenta i återinplantering hematopoetiska härstamningar som båda TET2+/- och TET2- / - Förenta utvecklat olika hematopoietiska maligniteter17,18. Dessa studier visar att haploinsufficiency av TET2 dioxygenas förändrar utvecklingen av Förenta och resulterar i hematopoetiska maligniteter.
Liknar möss med mutationer i genen TET2, de flesta leukemipatienter manifestera haploinsufficiency TET2 dioxygenas verksamhet. Dessa mestadels heterozygot somatiska mutationer inkluderar ram-Skift och nonsens mutationer spridda över hela TET2 gen kroppen medan missense mutationer som är mest klustrade i dioxygenas domän12. Hittills har rapporteras lite karakterisering av wt - och mutant-TET2 i litteraturen främst på grund av svårigheter med produktionen av TET2 dioxygenas och dess analys21. Vi rapporterar här, en enkel steg rening av infödda TET2-dioxygenas använder jonbyteskromatografi. Ytterligare, en kvantitativ LC-MS/MS-analys var optimerad och används för att mäta den enzymatiska aktiviteten av infödda TET2-dioxygenas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

Epigenetiska transkription förordningen medieras av 5-metylcytosin (5mC) har spelat en avgörande roll i eukaryota utveckling. Demetylering av märkena epigenetiska åstadkoms genom sekventiell oxidation av tio-elva translokation dioxygenases (TET1-3), följt av tymin-DNA glykosylas-beroende base excision reparation. Inaktivering av TET2-genen på grund av genetiska mutationer eller genom andra epigenetiska mekanismer är associerade med en dålig prognos hos patienter med olika cancerformer, särskilt hematopoetiska maligniteter. Här beskriver vi en effektiv enda steg rening av enzymatiskt aktiva otaggade mänskliga TET2-dioxygenas med katjonbytare kromatografi. Vi tillhandahåller ytterligare en liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) tillvägagångssätt som kan separera och kvantifiera de fyra normala DNA-baserna (A, T, G och C), samt de fyra modifierade cytosin baserna (5-metyl, 5-hydroxymetyl, 5-formyl, och en 5-karboxylgrupp). Denna analys kan användas för att utvärdera aktiviteten av vildtyp och mutant TET2 dioxygenases.

Dynamisk ändring av 5mC i DNA av TET-familjen dioxygenases spelar viktiga roller i epigenetiska transkriptionell förordningar. TET2 dioxygenas är ofta muterad i olika hematopoietiska maligniteter12. För att undersöka betydelsen av enzymet TET2 i normala utveckling och sjukdom, har vi klonade dess minimala catalytically aktiv domän utan någon affinitet tagg in pDEST14 vector22. De otaggade TET2-dioxygenas producerades på ∼5% av det ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Här presenterar vi ett protokoll för en effektiv enda steg rening av aktiva otaggade människa tio-elva translokation-2 (TET2) 5-metylcytosin dioxygenas använder jonbyteskromatografi- och dess analys med hjälp av en flytande kromatografi-tandem mass masspektrometri (LC-MS/MS)-baserat tillvägagångssätt.

Effektiv rening och LC-MS/MS-baserad analys utveckling för tio-elva translokation-2 5-metylcytosin dioxygenas

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i epigenetik och TET2 medierad 5-Methylcytosine demetylation fält sådan en analys av verksamhet av normala och kliniska TET2 mutationer. Den största fördelen med denna teknik är att infödda TET2 kan renas i ett enda steg, och dess verksamhet kan analyseras i form av bildandet av alla tre produkter. Flera doktorander kommer att demonstrera förfarandet.Proteinreningen kommer att utföras av Chayan Bhattacharya, TET2-analysen av Aninda Sundary Dey, och LC-MS/MS-analysen av Navid Ayon. För bakteriell omvandling, tillsätt en mikroliter av rekombinant pDEST 14 destination uttryck vektor som innehåller untagged mänskliga TET2 dioxygenas till 100 mikroliter av kemiskt behöriga E.coli BL21 DE3 celler i en 1,7 milliliter rör. Efter inkubation på is i minst 15 minuter, värme chock blandningen på 42 grader Celsius i 30 sekunder i ett vattenbad.Omedelbart efter värmechock, placera cellerna tillbaka på is i minst två minuter. Efter detta, tillsätt 250 mikroliter av super optimal buljong med katabolit förtryck till celler. Inkubera bakteriecellerna i en timme vid 37 grader Celsius i en shaker.Efter inkubationen snurrar du ner cellerna genom att centrifugera röret vid 9, 000 gånger gravitationen i en minut. Kassera 70% av supernatanten genom pipettering, och lös upp pelleten i de återstående medierna. Sprid cellupphängningen på en Liruabuljongagarplatta innehållande 100 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkubera plattan i 16 timmar vid 37 grader Celsius. Välj en isolerad koloni, och inokulera den i 10 milliliter lb ampicillin media. Inkubera röret i 37 grader Celsius i en shaker över natten.Efter detta, använd 100 mikroliter av bakteriekultur att inokulera 100 milliliter lb ampicillin media som en primär kultur. Inkubera röret i 37 grader Celsius i en shaker över natten. Nästa dag, inokulera 15 kolvar, vardera innehållande 600 milliliter LB ampicillin media med sex milliliter primärkultur per kolv.Inkubera kolvarna i 37 grader Celsius på en skakmaskin vid 180 RPM. För att kontrollera tätheten av bakteriekulturen, mäta dess optiska densitet vid 600 nanometer, eller OD600, med hjälp av en spektrofotometer. Efter att kulturen nått en densitet på 0,8 vid OD600, inducera uttrycket av TET2 protein med 300 mikroliter av en molar IPTG i varje kolv, och odla kulturen i ytterligare 16 timmar vid 17 grader Celsius.Efter inkubation, överför bakteriekulturen till centrifugflaskor. Centrifugera den bakteriekultur som uttrycker TET2-enzymet vid 5, 250 gånger gravitation i 45 minuter. Använd bakteriepelleten för TET2-rening.Arbeta på is eller vid fyra grader Celsius, åter upphäva bakteriepellets i 100 milliliter av 50-millimolar MES buffert, pH sex. Ta sedan fem milliliter av cellupphängningen, och föra den till 45 milliliter med bufferten. Sonikera upphängningen i fem gånger 30 sekunder vid effekt 20, med 60-sekunders kylintervall.Snurra på lysate på 5, 250 gånger gravitation i 45 minuter. Samla upp supernatanten som innehåller det lösliga TET2-enzymet, och för det genom 0,45 mikronfilter innan du laddar på ett FPLC-system. Packa 30 milliliter av en stark katjonbytarharts till en FPLC-kolonn.Jämviktskolonnen med 10 bäddvolymer av tvättbuffert vid konstant flödeshastigheten på 0,3 milliliter per minut med hjälp av ett FPLC-system. Ladda den klargj橬一j lysateen in på denpre-equilibrated kolonnen, och wash med ungefärligt 10 sängvolymer av washbuffert, tills flödet-through blir fri. Elute TET2 med en noll till 10%-gradient från tvättbufferten till elueringsbufferten i 15 bäddsvolymer, följt av en spärr vid 10%elueringsbuffert för två sängvolymer.Samla 100 microliter prover av cell lysate före och efter kolumn lastning, tillsammans med alla elution fraktioner, och analysera på 10%lösa SDS-PAGE gel. Poola de fraktioner som innehåller TET2-protein och frystorka proteinet. Lös sedan upp enzymet i 10 milliliter vatten, och förvara på minus 80 grader Celsius.Utför alla demetyleringsreaktioner i tre exemplar med tre mikrogram substrat. Tillsätt 100 mikrogram renat TET2-enzym till 50 mikroliter av total reaktionsbuffert. Efter en timmes inkubation vid 37 grader, släck TET2 katalyserade oxidation reaktioner med fem mikroliter av 500-millimolar EDTA.För att förbereda prover för analys, separera DNA från TET2 reaktionsblandningen genom att först lägga till 100 mikroliter av Oligo bindningsbuffert till 55 mikroliter av släckt reaktion. Efter detta, tillsätt 400 mikroliter av 100%etanol till blandningen. Passera denna blandning genom en Oligo bindning kolumn.Efter tvättning av bundna DNA med 750 mikroliter av tvättbuffert, elute dna i 20 mikroliter vatten. Nu, smälta den isolerade DNA med två enheter av DNase I och 60 enheter av S1 nukleas vid 37 grader Celsius i 12 timmar för att producera enskilda nukleosid monofosfater. Efter matsmältningen, tillsätt två enheter av kalv intestinala alkaliska fosfatas till proverna.Inkubera i ett tillägg 12 timmar vid 37 grader Celsius för att ta bort terminalfosfatgrupperna från nukleosidmonofosfaterna, och få tag i nukleosderna. Bered en 100-mikromolär stamlösning av alla de modifierade cytosinnukleosider, och de normala DNA-baserna i HPLC-grade vatten för utveckling av LC-MS/MS-metoden. Optimera parametrarna för nukleosidberoende MS/MS genom att infusera lagerlösningar en i taget i masspektrometern med en flödeshastighet på 10 mikroliter per minut i utökat MS-skanningsläge.Flera parametrar kan optimeras med hjälp av den automatiserade kvantitativa optimeringsfunktionen i programvaran för varje DNA-nukleosid. Vid denna punkt, optimera de återstående parametrarna för varje DNA-nukleosid med hjälp av den manuella kvantitativa optimeringsfunktionen i programvaran i flödesinjiceringsanalysläge. Nu, optimera källberoende MS / MS parametrar genom att injicera 10 mikroliter av stamlösning med hjälp av en gradient med 25%lösningsmedel B vid en flödeshastighet på 0,3 milliliter per minut.För att separera alla åtta DNA-nukleosider, utför vätskekromatografi som detaljerad i textprotokollet på en C18-kolumn. Slutligen, upptäcka och kvantifiera alla nukleosider med LC-MS/MS-metoden i standardkurvor. Eftersom den katalytiska domänen för TET2 har en relativt hög isoelektrisk punkt jämfört med de flesta inhemska E.coli proteiner, en effektiv rening process utnyttja en katjon utbyte kromatografi utvecklades.Denna rening gav större än 90%ren TET2 enzym i ett enda steg. För att separera och kvantifiera olika deoxycytidinderivat och de fyra naturliga DNA-baserna efter TET2-enzymatiska reaktionen optimerades en känslig LC-MS/MS-baserad analys. Standardkurvor drogs med hjälp av serieutspädningar av en blandning som innehåller alla nukleosider.Resultaten av metoden med vätskekromatografi MS/MS visas här. Metoden möjliggör separation och kvantifiering av de fyra normala DNA-baserna, liksom de fyra modifierade cytosinbaserna. I detta experimentella förfarande beskriver vi kloning av untagged mänskliga TET2 dioxynase katalytisk domän med hjälp av platsspecifika rekombination teknik och ett tillräckligt uttryck i en destination vektor i E.Coli.Vi effektivt renas untagged TET2 enzym utnyttja katjon utbyte kromatografi att ge större än 90%renhet i ett enda steg. Vidare har vi utvecklat en ny vätskekromatografimetod för att separera de fyra normala DNA-baserna och de fyra modifierade cytosinbaserna. För att kvantifiera de åtta nukleosider från TET2 katalyseras reaktioner, har vi kopplade vår förbättrade flytande kromatografi metod med tandem massa spectrometry.Den känsliga LC-MS/MS-analysen utnyttjades sedan för att fastställa aktiviteten hos rekombinant untagged human TET2-enzym. Det tillvägagångssätt som beskrivs här kommer att kraftigt öka värderingen av vilda-typ och mutantA TET2 dioxygenas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile och effektiv strategi för produktion av Vändbar disulfid Tvärbundna Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry - en metod för bedömning av termisk stabilitet och konformationen av proteinantigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttryck och rening av Nukleasfri syre avskiljare Protocatechuat 3, 4-dioxygenas

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Utvinning, rening och profilering av gangliosid

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Rening av endogena Drosophila transienta receptorpotentialkanaler

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...