Name: efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Bu araştırma ABD Savunma Bakanlığı bir fikir Ödülü (W81XWH-13-1-0174), aplastik anemi ve MDS Vakfı Hibe şeklinde tarafından finanse edildi ve UMRB grant mm yazarlara teşekkür Mohit Jaiswal ve Subhradeep Bhar ilk TET2 pDEST14 vektörde klonlama için.

1. klonlama ve etiketsiz insan TET2 Dioxygenase arıtma
<ol><li>İnsan TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) yukarıda açıklanan22siteye özgü rekombinasyon teknikle pDEST14 hedef vektör içine kopyalayın. Not: Önceki çalışmalarda C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) etki alanı en az catalytically etkin etki alanı21,23olduğunu göstermiştir. PDONR221 vektör kullanarak etiketsiz TET2 dioxygen...

<ol>
	<li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+landscapes:+provocative+insights+from+epigenomics.">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development.">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905 (2013).</li><li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain.">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+body+epigenome+maps+reveal+noncanonical+DNA+methylation+variation.">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li><li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+epigenetic+states.">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li><li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development.">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li><li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development.">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li><li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids.">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li><li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation.">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes.">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li><li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins,+but+indicates+no+definite+prognostic+value.">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li><li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation.">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li><li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis.">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies.">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-Eleven-Translocation+2+(TET2)+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li><li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+expression,+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase.">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation.">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum's+disease.">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li><li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+co-substrate+rescue+of+phytanoyl-Co+A+2-hydroxylase+(PAHX)+mutants+causing+adult+Refsum's+disease.">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li><li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid.">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia.">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li><li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+Regulates+Mast+Cell+Differentiation+and+Proliferation+through+Catalytic+and+Non-catalytic+Activities.">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li><li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells.">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li></ol>

TET2 gen mutasyonlar çeşitli hematopoetik maligniteler olan hastalarda en sık saptanan genetik değişiklikler vardır. Mutasyonların saçma, çerçeve-shift ve missense mutasyonlar içeren farklı TET2, bugüne kadar yüzlerce hastalar12tespit edilmiştir. TET2 mutasyonlar hastalarda kemik iliği wt-TET214olanlarla karşılaştırıldığında genomik 5hmC seviyesinin düşük gösterir. Mutant TET2 çakma deneyler Bu mutasyonlar 5hmC düzeyleri,<sup ...

C5 sitozin üsleri KSY dinucleotides içinde (5mCpG) baskın metilasyonu sitedeki memeli genleri1konumudur. Buna ek olarak, son çalışmalar bir dizi sigara CpG siteler kapsamlı C5 sitozin metilasyonu (5mC) ortaya (5mCpH, nerede H = A, C veya T)2,3. 5mC değişiklik endojen retrotransposons ve gen Rehberleri3,4,5, transkripsiyon bir susturucu olarak hizmet vermektedir. DNA metilasyonu 5mC, aynı zamanda X kromozomu inactivation, gen sürecinden, nükleer yeniden programlama ve doku özel gen ifade5,6,7önemli rol oynar. C5 konumundaki sitozin metilasyonu DNA methyltransferases tarafından yürütülen ve önemli gelişimsel kusurlar8bu enzimler mutasyonların neden. 5mC işaretleri kaldırılması TET1-3 5mC oxidases9,10tarafından başlatılan. Bu TET-aile dioxygenases 5mC değiştirmek içine 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxylcytosine (5caC) tarafından sıralı oksidasyon adımları11,12,13. Son olarak, timin-DNA glycosylase 5 fC veya değiştirilmemiş sitozin baz eksizyon tamir yol11kullanarak için 5caC yerini alır.
İnsan TET2 gen myelodisplastik sendrom (MDS)14,15,16, MDS miyoproliferatif neoplazmlar () de dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik maligniteler sık mutasyona uğramış bir gen olarak tespit edildi MDS-MPN) ve MDS ve MDS-MPN16kaynaklanan akut miyeloid lösemi (AML). Vahşi türü (wt) olanlar karşılaştırıldığında TET2 mutasyonları ile kemik iliği DNA 5hmC değişiklik düzeyde hastalarda alt-TET214. Grup sayısı normal hematopoiesis ve myeloid dönüştürme17,18,19,20rolünü aydınlatmak için TET2-nakavt fare modelleri geliştirdi. Bu fareler TET2 gen mutasyonları ile başlangıçta normal ve uygun, ama onlar kendi erken ölümüne neden olan yaşlı gibi çeşitli hematopoetik maligniteler ortaya. Bu çalışmalar normal hematopoetik ayrımında wt TET2 oynadığı önemli roller gösterdi. Bu fare modelleri, heterozigoz hematopoetik kök hücre (TET2+ / HSCs) ve homozigoz TET2- / - HSCs hematopoetik soy kullanıma her iki TET2+/- içinde homozigoz wt-TET2 HSCs rekabet avantajı vardı ve TET2- / - HSCs çeşitli hematopoetik maligniteler17,18. Bu çalışmalar dioxygenase HSCs gelişimi değiştirir ve hematopoetik maligniteler sonuç TET2 bu haploinsufficiency göstermektedir.
Benzer şekilde TET2 gen mutasyonları ile fareler, çoğu lösemi hasta haploinsufficiency TET2 dioxygenase faaliyet gösterecektir. Bu çoğunlukla Heterozigoz somatik mutasyon TET2 gen vücut çoğu missense mutasyon süre boyunca dağınık çerçeve-shift ve anlamsız mutasyon dahil dioxygenase etki alanı12' kümelenmiş. Bugüne kadar küçük karakterizasyonu wt mutant TET2, özellikle TET2 dioxygenase ve onun tahlil21üretimi ile zorluklar nedeniyle literatürde bildirilmektedir. Burada, yerel TET2 dioxygenase İyon Kromatografi kullanarak basit bir tek adım arıtma raporu. Ayrıca, nicel bir LC-MS/MS tahlil en iyi duruma getirilmiş ve yerli TET2 dioxygenase enzim aktivitesini ölçmek için kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="739">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td style="width:119px;">FH31182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">&#945;-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:201px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Oligo clean and concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DNAse I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">S1 Nuclease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ENO321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">LB Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>J75852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">IPTG</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>EI05931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td>
			<td style="width:201px;">Carbosynth</td>
			<td>FM37015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP Sepharose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-002-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-methylcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D3610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>D4220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">5-Formyl-2&#39;-deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxycytidine</td>
			<td>Berry &#38; Associates</td>
			<td>PY 7216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyadenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND04011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxyguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>ND06306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2&#39;-Deoxythymidine</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97061-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gateway technology</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11801016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Beckman Allegra X-15R centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sonic Dismembrator 550</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#196;KTA FPLC system</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">18116468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FreeZone 4.5 freeze dry system</td>
			<td style="width:201px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7750020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Zymo Oligo purification columns&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">BDS Hypersil C18 column</td>
			<td style="width:201px;">Keystone Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">105-46-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3200 Q-Trap mass spectrometer</td>
			<td style="width:201px;">AB Sciex</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HPLC&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Shimadzu HPLC&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">XK16/20 FPLC column</td>
			<td style="width:201px;">Pharmacia (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient purification and lc-ms/ms-based assay development for ten-eleven translocation-2 5-methylcytosine dioxygenase

5-metilsitozin tarafından (5mC) aracılı epigenetik transkripsiyon yönetmelik ökaryotik gelişiminde önemli bir rol oynamıştır. Demethylation bu epigenetik izlerini timin-DNA glycosylase bağımlı baz eksizyon tamiri tarafından takip sıralı oksidasyon on-on translocation dioxygenases (TET1-3), tarafından sağlanır. TET2 gen genetik mutasyonlar nedeniyle veya diğer epigenetik mekanizmalar tarafından inactivation çeşitli kanserler, özellikle hematopoetik maligniteler olan hastalarda kötü prognoz ile ilişkilidir. Burada, enzimatik etkin etiketsiz insan TET2 dioxygenase ba * exchange Kromatografi kullanarak verimli tek adım arınma açıklayın. Biz daha fazla ayrı ve dört normal DNA baz (A, T, G ve C), (5-metil, 5-hydroxymethyl, 5-formyl ve 5-karboksil) dört değiştirilmiş sitozin baz yanı sıra ölçmek bir sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yaklaşım sağlar. Bu tahlil etkinlik vahşi türü ve mutant TET2 dioxygenases değerlendirmek için kullanılabilir.

TET-aile dioxygenases tarafından DNA ' 5mC dinamik modifikasyonu epigenetik transkripsiyon yönetmeliğinde önemli rol oynar. TET2 dioxygenase sık sık çeşitli hematopoetik maligniteler12' mutasyona uğramış. Normal geliştirme ve hastalık TET2 enzimi rolünü araştırmak için biz-klonlanmış herhangi bir benzeşme etiketi olmadan en az catalytically etkin etki alanı pDEST14 vektör22. Etiketsiz TET2 dioxygenase bakteriyel SDS SA...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase at JoVE.com

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Bu yöntem epigenetik ve TET2 aracılı 5-Metiyatozin demetilasyon alanında normal ve klinik TET2 mutasyonlarının aktivitesinin analizigibi anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı yerli TET2'nin tek bir adımda saflaştırılaması ve faaliyetinin her üç ürünün oluşumu açısından analiz edilebilmektedir. Birkaç lisansüstü öğrenci prosedürü gösterecektir.Protein arınması Chayan Bhattacharya, Aninda Sundary Dey'nin TET2 tahlilleri ve Navid Ayon'un LC-MS/MS analizi ile gerçekleştirilecektir. Bakteriyel dönüşüm için, 1.7 mililitrelik bir tüpte kimyasal olarak yetkin 100 mikrolitre E.coli BL21 DE3 hücresine etiketsiz insan TET2 dioksijenaz içeren bir mikrolitre rekombinant pDEST 14 hedef ekspresyonu vektörü ekleyin. En az 15 dakika buz üzerinde kuluçka sonra, ısı bir su banyosunda 30 saniye boyunca 42 santigrat derece karışımı şok.Isı şokundan hemen sonra, hücreleri en az iki dakika buza geri yerleştirin. Bunu takiben, hücrelere katabolit baskı ile süper optimal suyu 250 mikrolitre ekleyin. Bir shaker içinde 37 santigrat derece bir saat için bakteri hücreleri kuluçka.Kuluçkadan sonra, tüpü 9,000 kat yerçekimini bir dakika lığına santrifüj ederek hücreleri aşağı çevirin. Pipetleme ile supernatant% 70 atın ve kalan ortamda pelet eritin. Mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren lirua suyu agar plaka üzerinde hücre süspansiyon yayıldı.Plakayı 16 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. İzole edilmiş bir koloni seçin ve 10 mililitre LB ampisilin ortama dönüştürün. Tüpü bir gecede 37 derecede bir çalkalayıcıyla kuluçkaya yatırın.Bunu takiben, birincil kültür olarak 100 mililitre LB ampisilin media'yı aşılamak için 100 mikrolitre bakteri kültürü kullanın. Tüpü bir gecede 37 derecede bir çalkalayıcıyla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her biri 600 mililitre LB ampisilin medya içeren ve şişe başına altı mililitre birincil kültür içeren 15 şişeyi inoküle edin.Şişeleri 180 RPM'de bir çalkalayıcıyla 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bakteri kültürünün yoğunluğunu kontrol etmek için optik yoğunluğunu 600 nanometre veya OD600 olarak spektrofotometre kullanarak ölçün. Kültür OD600'de 0.8 yoğunluğa ulaştıktan sonra, her şişede bir azı iptg 300 mikrolitre ile TET2 proteinekspresaneden ve 17 santigrat derece ek bir 16 saat için kültür büyümek.Kuluçkadan sonra bakteri kültürünü santrifüj şişelerine aktarın. TET2 enzimini 5, 250 kat yerçekiminde ifade eden bakteri kültürünü 45 dakika santrifüj edin. TET2 arıtma için bakteriyel pelet kullanın.Buz üzerinde ya da dört santigrat derecede çalışarak, 50 milimolar MES tampon, pH altı 100 mililitre bakteriyel pelet yeniden askıya. Sonra hücre süspansiyon beş mililitre almak ve tampon ile 45 mililitre getirmek. 60 saniyelik soğutma aralıklarıyla süspansiyonu güç 20'de beş kez 30 saniye sonicate edin.Lysate'yi 5,250 kez 45 dakika boyunca çevirin. Çözünür TET2 enzimini içeren süpernatant'ı toplayın ve bir FPLC sistemine yüklemeden önce 0,45 mikron filtreden geçirin. Bir FPLC sütununa 30 mililitre güçlü katyon değişimi reçinesini paketle.FPLC sistemi kullanarak kolonu dakikada 0,3 mililitre sabit akış hızında 10 yatak hacmi ile dengeleyin. Açıklığa kavuşturulmuş lisate'yi önceden dengelenmiş kolona yükleyin ve akış netleşene kadar yaklaşık 10 yatak hacmi nde yıkama tamponu ile yıkayın. Elute TET2, yıkama tamponundan 15 yatak hacminde elüsyon tamponuna sıfır ila %10 degrade kullanarak, ardından iki yatak hacmi için %10 elüsyon tamponu tutar.Kolon yüklemesinden önce ve sonra 100 mikrolitre likit örneği, tüm elüsyon fraksiyonları ile birlikte toplayın ve SDS-PAGE jelini %10 oranında analiz edin. TET2 proteini içeren fraksiyonları havuza alın ve proteini dondurun-kurulayın. Sonra enzimi 10 mililitre suda çözün ve eksi 80 derecede saklayın.Üç mikrogram substrat ile triplicate tüm demetilasyon reaksiyonları gerçekleştirin. Toplam reaksiyon tampon50 mikrolitre saflaştırılmış TET2 enzimi 100 mikrogram ekleyin. 37 derecede bir saatlik kuluçkadan sonra, TET2 katalize edilmiş oksidasyon reaksiyonlarını 500 milimolar EDTA'lık beş mikrolitre ile söndürün.Analiz için numune hazırlamak için, DNA'yı TET2 reaksiyon karışımından ilk olarak 55 mikrolitre sönme reaksiyonuna 100 mikrolitre Oligo bağlayıcı tampon ekleyerek ayırın. Bunu takiben, karışıma% 100 etanol 400 mikrolitre ekleyin. Bu karışımı oligo bağlayıcı sütunundan geçirin.Ciltli DNA'yı 750 mikrolitre yıkama tamponuyla yıkadıktan sonra, 20 mikrolitre sudaki DNA'yı eleyin. Şimdi, izole edilmiş DNA'yı iki ünite DNase I ve 60 ünite S1 nükleazını 37 derecede 12 saat boyunca tek tek nükleozit monofosfatlar üretelim. Sindirimden sonra, örneklere iki ünite baldır bağırsak alkalen fosfataz ekleyin.37 santigrat derecede 12 saat ek olarak çekirdekofosfatlardan terminal fosfat gruplarını çıkarın ve nükleozitleri elde edin. LC-MS/MS yönteminin geliştirilmesi için tüm modifiye sitozin nükleozitlerinin 100 mikromolar stok çözeltisini ve HPLC sınıfı sudaki normal DNA bazlarını hazırlayın. Gelişmiş MS tetkik modunda dakikada 10 mikrolitre akış hızında stok çözümlerini kütle spektrometresinde birer aşılayarak nükleozite bağımlı MS/MS parametrelerini optimize edin.Her DNA nükleoziti için yazılımın otomatik kantitatif optimizasyon özelliği kullanılarak çeşitli parametreler optimize edilebilir. Bu noktada, akış enjeksiyon analizi modunda yazılımın manuel kantitatif optimizasyon özelliğini kullanarak her DNA nükleoziti için kalan parametreleri optimize edin. Şimdi, dakikada 0,3 mililitre akış hızında %25 çözücü B ile bir degrade kullanarak 10 mikrolitre stok çözeltisi enjekte ederek kaynağa bağımlı MS/MS parametrelerini optimize edin.Sekiz DNA nükleozitini ayırmak için, C18 sütunundaki metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi sıvı kromatografisi yapın. Son olarak, standart eğrilerde LC-MS/MS yöntemini kullanarak tüm nükleozitleri tespit edin ve ölçün. TET2'nin katalitik etki alanı, çoğu yerli E.coli proteini ile karşılaştırıldığında nispeten yüksek izoelektrik bir noktaya sahip olduğundan, katyon değişimi kromatografisi kullanan verimli bir arıtma süreci geliştirilmiştir.Bu saflaştırma tek bir adımda %90'dan fazla saf TET2 enzimi elde etti. TeT2 enzimatik reaksiyonu sonrasında farklı deoksisitin türevlerini ve dört doğal DNA tabanını ayırmak ve ölçmek için hassas bir LC-MS/MS bazlı test optimize edildi. Standart eğriler, tüm nükleozitleri içeren bir karışımın seri seyreltmeleri kullanılarak çizilmiştir.Sıvı kromatografims/MS yönteminin sonuçları burada gösterilmiştir. Yöntem, dört normal DNA bazlarının ve dört modifiye sitozin tabanının ayrılmasına ve ölçülmesine olanak sağlar. Bu deneysel prosedürde, e-Coli'de bir hedef vektörde, siteye özgü rekombinasyon tekniği ve yeterli bir ifade kullanılarak etiketsiz insan TET2 dioksinase katalitik etki alanının klonlanması anlatMaktadır.Tek bir adımda %90 saflıktan daha fazla saflık elde etmek için katyon değişimi kromatografisini kullanan etiketsiz TET2 enzimini verimli bir şekilde saflaştırdık. Ayrıca, dört normal DNA bazını ve dört modifiye sitozin tabanını ayırmak için yeni bir sıvı kromatografi yöntemi geliştirdik. TET2 katalize reaksiyonlarından sekiz nükleoziti ölçmek için geliştirilmiş sıvı kromatografi yöntemimizi tandem kütle spektrometresi ile birleştirdik.Daha sonra rekombinant etiketsiz insan TET2 enziminin aktivitesini belirlemek için hassas LC-MS/MS teşelesi kullanıldı. Burada açıklanan yaklaşım büyük ölçüde yabani tip ve mutant TET2 dioksijenaz değerleme artıracaktır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...