Name: a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions at JoVE.com

ونحن نشكر الموظفين داخل معهد "الوراثة البشرية" لإعداد مكتبة خ ع وتسلسلها. ونحن نشكر سنير آنيات لخبرتها في إعداد مكتبة الجينوم الشظايا لمكتبة بلازميد Y2H هنا. هذا العمل كان يدعمها في "المعاهد الوطنية للصحة": R21 المعاهد الوطنية للصحة EB021870-01A1 و "منحة مشروع بحوث جبهة الخلاص الوطني": 1517110.

1-إعداد وسائل الإعلام ولوحات
ملاحظة: جميع لوحات تحتاج إلى بذل الحد الأدنى 2 أيام قبل البدء بالبروتوكول. ويمكن إجراء وسائل الإعلام عند أي نقطة. ومع ذلك، استخراج الخميرة مخزنة ببتون الدكستروز الأدنين (بيبدا) يحتاج إلى بذل في اليوم الذي سيتم استخدامه. بعض وسائل الإعلام باستخدام م...

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+two-hybrid+assay:+still+finding+connections+after+25+years.">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements.">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li><li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins.">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li><li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast.">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+of+Proteins.">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates.">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li><li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases.">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li></ol>

هنا نقدم دليل لكيفية إجراء فحوصات Y2H دفعة واحدة باستخدام طرق محسنة. وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في الإجراء للمساعدة على ضمان أن سكان الخميرة التي ستوضع تحت التحديد ممثل مكتبة البداية وأن ما يكفي من السكان الخميرة انطلاق يستخدم الخضوع للتحديد للحد من تقلب . الأهم من ذلك، هذه المقاييس ?...

فهم كامل للعمليات البيولوجية الخلية يعتمد على إيجاد شبكات التفاعل البروتين التي تكمن وراء تلك الآليات الجزيئية. يتمثل أحد النهج لتحديد تفاعلات البروتين المقايسة الخميرة 2-هجين (Y2H)، الذي يعمل عن طريق تجميع عامل نسخ تشيميريك تعمل بمجرد ربط بين البروتين المجالات ذات الاهتمام ببعضها1. شاشة Y2H نموذجية يتم عن طريق إنشاء عدد أن خميرة التي يضم كل مكتبة من البلازميدات ترميز البروتينات المتفاعلة التي تنصهر فيها منشط النسخي (مثلاً.، 'فريسة' البروتين الانصهار) وبلازميد معين 'طعم' تتألف من البروتين من مصلحة تنصهر إلى مجال ربط الحمض النووي (مثلاً، Gal4 الحمض النووي ملزم المجال الذي يربط إلى تسلسل تفعيل Gal4 المنبع). واحدة من المزايا الرئيسية للنهج الذي Y2H هو أن من السهل نسبيا وغير مكلفة لقواعد السلوك في مختبر نموذجية مجهزة للعمل الروتيني البيولوجية الجزيئية2. ومع ذلك، عندما تؤدي تقليديا، عينات مستخدم المستعمرات الفردية التي تنشأ عند التحديد لتفاعل إيجابي Y2H. وهذا يحد بشدة من عدد النسخ 'فريسة' المكتبة التي يمكن أن تجري دراسة استقصائية. وتتفاقم هذه المشكلة عند وفرة فريسة متفاعلة خاصة مرتفع جداً بالنسبة للآخرين، تتضاءل فرصة للكشف عن التفاعل من وفرة منخفضة فريسة والبلازميدات.
هو حل واحد لاستخدام مبدأ Y2H في تغطية شاملة للبروتين استخدام نهج المهيأة باستخدام مصفوفة حيث يمكن استجوابهم صفيف يحتوي على البلازميدات فريسة الفردية المعروفة رقمياً. ومع ذلك، يتطلب هذا نهج البنية أساسية التي لا يسهل موجوداً أو فعالة من حيث التكلفة للمحققين الأفراد الذين يرغبون في تحديد إينتيراكتومي لعدد قليل من البروتينات أو المجالات3. وباﻹضافة إلى ذلك، ستوسع المكتبات فريسة المعقدة جداً التي قد ترميز أجزاء متعددة من البروتينات المتفاعلة حجم هذه المصفوفات مصفوفة لأحجام غير عملي. وبديل هو إجراء فحوصات مع مكتبات المعقدة على دفعات وتقييم وجود المتفاعلة الحيوانات المستنسخة باستخدام التسلسل الفائق المتوازية الضخمة4. وهذا يمكن تطبيقه على الاعتداء وجود والبلازميدات الجارحة التي تنشأ في مستعمرات متعددة باستخدام نموذجي Y2H نهج يسمح لتنمو على5،لوحة6خلايا الإسكان على زوج متفاعلة من البروتينات الانصهار في الخميرة التي تمت تهيئتها. يمكن أن تتفاقم هذه الفكرة العامة لزيادة الاستعلام من كلا الطعم متعددة وفريسة المكونات في نفس الوقت7،8.
لا يزال العديد من التحقيقات تتطلب أسهل بعد أكثر تركيزاً الجهد على عدد قليل من البروتين 'الطعم' ويمكن أن تستفيد أكثر من استعلام حصرية وشبه كمي لمكتبة واحدة فريسة المعقدة. لدينا نمواً والتحقق من صحة نهج لإجراء دراسات التفاعل البروتين على نطاق واسع باستخدام مبدأ Y2H في دفعة الشكل4. هذا يستخدم معدل التوسع بلازميد فريسة معينة كوكيل للقوة النسبية ل التفاعل Y2H9. التسلسل العميق لجميع البلازميدات داخل مجموعة من سكان يتعرضون للنمو الطبيعي أو ظروف النمو الانتقائي وتنتج خريطة كاملة للحيوانات المستنسخة التي تسفر عن التفاعلات Y2H القوية والضعيفة. ويمكن الحصول على المرجع للتمثيلات ومقارنة مباشرة عبر متعددة الطعم والبلازميدات. وبالتالي يمكن استخدام سير العمل الناتجة عن وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين) لتحديد إينتيراكتوميس التفاضلية من نفس مكتبات فريسة لتحديد البروتينات، مما يتيح المقارنة بين بروتين واحد مقابل آخر.
وهنا نبدي ديبن وإدخال التحسينات في أساليب المختبرات التي يسهل استخدامها، الذي يرد في الشكل 1. تتضمن التحسينات الهامة:
جيل سكان فريسة الخميرة. أحد المتطلبات الرئيسية ديبن يولد سكان خميرة مع البلازميدات الطعم المختلفة التي لها نفس التوزيع للمكتبات فريسة بلازميد. السكان يعادل خط الأساس للمكتبة بلازميد فريسة ضرورية لإجراء مقارنات دقيقة بين إينتيراكتوميس الطعوم المختلفة. وهذا يتحقق على أفضل وجه عندما يقع بلازميد مكتبة الفعل في عدد سكان فرداني خميرة وتتحرك بلازميد طعم معطى إلى أن السكان يتحقق عن طريق التزاوج لإنتاج من مثنوية. وهنا، نحن نقدم دليل واضح في كيفية جعل هؤلاء السكان باستخدام المكتبات التجارية في الخميرة فرداني. على الرغم من أن نجد أساليب توليد عدد كبير من ديبلويدس، وكفاءة التزاوج عموما من هذه السلالات التجارية الخميرة التي تحتوي على مكتبة كان منخفضا. ولذلك، نحن شيدت سلالة جديدة التي يمكن البيت فريسة المكتبات التي تعطي ديبلويدس أكثر بكثير من كل رد فعل التزاوج.
مجموعة جديدة من الطعم والبلازميدات. العديد من البلازميدات الحالية التي تعبر عن 'الطعم' الانصهار البروتينات تتألف من البروتين الفائدة ومجال الحمض النووي ملزم تقوم على أساس 2µ، السماح لهم بتضخيم عدد النسخ. يمكن هذا الرقم نسخة متغير تماما في عدد السكان ويؤدي إلى تباين في استجابة النسخي Y2H. وهذا بدوره يمكن أن تحرف القدرة على قياس قوة تفاعل بروتين معين استناداً إلى استجابة نمو الخلايا ضمن التحديد. يمكن أن يكون هذا جزئيا إلى عنوان باستخدام بلازميد نسخة منخفضة، البعض منها قد وصفت سابقا مثل pDEST32 المتاحة تجارياً10. نحن شيدت بلازميد طعم جديد (بتيف-اختطارها) التي تنتج Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الانصهار البروتينات داخل بلازميد نسخة منخفضة على أساس السنترومير TRP1 تحمل الجينات المقاومة كانر أن يسمح أيضا باستنساخ الأجزاء الطعم المنبع و المتلقين للمعلومات في المجال Gal4 الحمض النووي ملزم.
مكتبة بلغة جديدة الكثافة Y2H. شيدت بلازميد جديد إلى البيت Y2H فريسة المكتبات، وأنها تستخدم لبناء مكتبة Y2H معقدة للغاية مصنوع من شظايا المنفصمة عشوائياً من الحمض النووي من Saccharomyces cerevisiae. أظهر تحليل تسلسل أن مكتبة هذه العناصر المختلفة ما يزيد على 1 مليون، الآن أكثر تعقيداً من الخميرة هو موضح سابقا المجينية Y2H بلازميد المكتبات11. مع هذه المكتبة الجديدة، كنا قادرين على إظهار أن يكون سير العمل ديبن قوية بما يكفي لاستيعاب مكتبات معقدة مع العديد من البلازميدات مختلفة على نحو يعول عليه وقابل لإعادة الإنتاج.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>deep sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-HA antibodies</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>901514</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal anti-myc antibodies</td>
			<td>QED Biosciences Inc</td>
			<td>18826</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NarI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0191S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>U2211-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td>
			<td>50-948-286</td>
			<td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>K22000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td>used for making DNA agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>155256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Sodium Salt</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>E57020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Leu-Met</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Met</td>
			<td>Bio 101, Inc</td>
			<td>4520-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>used for making media plates in section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4 Triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoehanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>U20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0492-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyper Prep kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK8500</td>
			<td>preparation kit for deep sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>http://www.jcat.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlocks</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strings</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td>
			<td>EPOCH Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E220</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td>high performance ultra-sonicator in section 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;- CGGTCTT 
			CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GAGTAACG 
			ACATTCCCAGTTGTTC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-CACCGTAT 
			TTCTGCCACCTCTTCC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GCAACCGC 
			ACTATTTGGAGCGCTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide 5&#8217;-GTTCCGATG 
			CCTCTGCGAGTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-GCACATGCT 
			AGCGTCAAATACC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-ACCCAAGCA 
			GTGGTATCAACG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;- TATTTAGA 
			AGTGTCAACAACGTA -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ69-4A MatA yeast strain</td>
			<td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436</td>
			<td></td>
			<td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTEF-GBD</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLY5725 MATalpha yeast strain</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>MATalpha his3&#8710;1 leu2&#8710;0 lys2&#8710;0 ura3&#8710;0 gal4&#8710; trp1&#8710; Gal80&#8710;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGal4AD (pPL6343)</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-activation domain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>Kord-Vallmark sold by VWR</td>
			<td>2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X 150 mm Disposable Culture Tube</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Griffin Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-572-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 190</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>used to measure the Optical Density of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Spectrophotometer used to quantify amount of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic UV transilluminator</td>
			<td>Ultra Lum</td>
			<td>MEB 20</td>
			<td>used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123600G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F144802G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1236-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;LLow Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L XL Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>TC9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318949-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>5674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden applicators</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>55900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA931-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td>ECL detection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutitron 2</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630482</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630488</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGADT7 AD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630442</td>
			<td>commercially available AD Vector housing many cDNA libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630443</td>
			<td>commercially available DNA-BD Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolase DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21042</td>
			<td>DNA polymerase used for section 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-6050-60</td>
			<td>pcr machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.5 mL PCR tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions

الفحص لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام مقايسة 2-الهجين الخميرة منذ فترة طويلة أداة فعالة، ولكن إلى حد كبير استخدام محدود لاكتشاف التمثيلات النسب العالية التي يتم التخصيب في مكتبة المرشحين المتفاعلة. في تنسيق تقليدية، يمكن أن تسفر عن التحليل 2-الهجين الخميرة مستعمرات كثيرة جداً لتحليل عندما أجرت في صرامة منخفضة حيث يمكن العثور على التمثيلات تقارب منخفضة. وعلاوة على ذلك، دون استجواب شاملة وكاملة من المكتبة نفسها ضد والبلازميدات الطعم مختلفة، لا يمكن تحقيق إجراء تحليل مقارن. على الرغم من أن بعض هذه المشاكل يمكن معالجتها استخدام مكتبات صفت فريسة، التكلفة والبنية التحتية اللازمة لتشغيل هذه الشاشات يمكن أن تكون باهظة. كبديل لذلك، ونحن قد تكيفت المقايسة 2-الهجين الخميرة في الوقت نفسه كشف العشرات من عابرة وتفاعلات البروتين ثابتة داخل شاشة واحدة استخدام استراتيجية وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين)، التي ويتضمن تسلسل الحمض النووي الفائق وحساب متابعة تطور عدد سكانها والبلازميدات ترميز الشركاء متفاعلة فيما بينها. وهنا يصف لنا الكواشف مخصصة والبروتوكولات التي تسمح شاشة ديبن ليتم تنفيذها بسهولة وفعالية من حيث التكلفة.

الإنزيم Y2H وقد استخدمت على نطاق واسع لإيجاد تفاعلات البروتينات: البروتين، وقد وضعت عدة تكييفات ونظم. معظمها، أن نفس الاعتبارات التي تساعد على ضمان نجاح هذه النهج السابقة تعتبر هامة ديبن. بعض المعايير الهامة تشمل: ضمان التعبير عن مجال الحمض النووي ملزم البروتينات الانصها?...

Watch this Scientific Journal Video about A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions at JoVE.com

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين

تجهيز دفعة من الخميرة 2-الهجين شاشات تسمح بالمقارنة المباشرة لملامح متعددة الطعم البروتينات التفاعل مع مجموعة معقدة جداً من البروتينات الانصهار فريسة. هنا، يمكننا وصف الأساليب المكررة، الكواشف الجديدة، وكيفية تطبيق استخدامها لهذه الشاشات.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...