Name: a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions at JoVE.com

Nous remercions le personnel au sein de l’Institut de génétique humaine de séquençage et de préparation de bibliothèque NGS. Nous remercions Einat Snir pour son expertise dans la préparation des fragments de banque génomique pour la bibliothèque de plasmide Y2H faite ici. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health : NIH R21 EB021870-01 a 1 et de subvention de projet de recherche FNS : 1517110.

1. préparation des plaques et des médias
Remarque : Toutes les plaques il faut faire au minimum 2 jours avant de commencer le protocole. Les médias peuvent être faites à tout moment. Toutefois, l’adénine de dextrose peptone tamponnée levure extrait (bYPDA) doit être faite le jour dont il sera utilisé. Certains médias s’effectue avec un mélange de supplément contenant une concentration de l’adénine est supérieure à ce qui est généralement utilisé. La plupart des suppléme...

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+two-hybrid+assay:+still+finding+connections+after+25+years.">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Rajagopala, S. 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Ici, nous fournissons un guide pour savoir comment effectuer les dosages Y2H en lot à l’aide de méthodes optimisées. Il y a quelques étapes cruciales dans la procédure pour s’assurer que la population de levures qui seraient placés sous la sélection est représentatif de la bibliothèque de départ et que suffisamment de la population de levures départ sert à subir une sélection afin de limiter la variabilité . Ce qui est important, ces repères sont relativement faciles à réaliser aux côtés d’adapte...

Une compréhension complète des processus biologiques de cellule s’appuie sur la recherche des réseaux d’interactions protéiques qui sous-tendent leurs mécanismes moléculaires. Une approche pour identifier les interactions entre protéines est la levure 2-hybride (Y2H), qui fonctionne en assemblant un facteur de transcription chimérique fonctionnement une fois que les deux domaines de la protéine d’intérêt lient à un autre1. Un écran Y2H typique est effectué en créant une population de levures qui abrite les deux une bibliothèque des plasmides codant des protéines qui interagissent, fusionnés à un activateur de la transcription (e.g., « la proie » protéine de fusion) et un plasmide de donnée « appât » composé de la protéine d’intérêt fusionné à un domaine de liaison de l’ADN (par exemple, le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 qui se lie à la séquence activatrice Gal4-amont). L’un des principaux avantages de l’approche Y2H est qu’il est relativement facile et peu coûteux à réaliser dans un laboratoire typique équipé pour les travaux courants de biologique moléculaire2. Toutefois, lorsque traditionnellement effectué, un utilisateur échantillonne des colonies individuelles qui surviennent après la sélection d’une interaction positive de Y2H. Cela limite fortement le nombre de clones de « proies » de bibliothèque qui peuvent être interrogés. Ce problème est aggravé lorsque l’abondance d’une proie interaction particulière est très élevé par rapport aux autres, ce qui diminue les chances d’apercevoir l’interaction de plasmides de proies de faible abondance.
Une solution pour utiliser le principe Y2H dans une couverture complète du protéome est l’utilisation d’une matrice au format dans lequel un tableau contenant des plasmides de proies individuels connus peut être interrogé numériquement. Toutefois, une telle approche exige une infrastructure qui n’est pas facilement accessible et le plus rentable pour les chercheurs qui s’intéressent à la définition de l’interactome d’un petit nombre de protéines ou domaines3. En outre, bibliothèques de proies très complexe qui peuvent coder plusieurs fragments de protéines qui interagissent augmenterait la taille de tels tableaux matrice aux tailles impraticables. Une alternative consiste à effectuer des essais avec des bibliothèques complexes en lots et d’évaluer la présence de clones interagissants avec le séquençage haut débit parallèle massive4. Ceci peut être appliqué pour doser la présence de plasmides de proies qui se posent dans plusieurs colonies au moyen d’un typique Y2H formaté approche dans laquelle la levure cellules abritant une paire d’interaction des protéines de fusion sont autorisés à cultiver sur un plaque5,6. Cette idée générale peut être accentuée pour augmenter la requête de deux appâts multiples et la proie de composants dans le même temps7,8.
Pourtant, nombreuses enquêtes exigent qu'une plus facile encore plus concentré efforts sur quelques protéines « appâts » et puissent bénéficier davantage par une requête exhaustive et semi-quantitative d’une bibliothèque de proies complexe unique. Nous avons développé et validé une approche pour effectuer des études d’interaction de protéine à grande échelle en utilisant un principe Y2H lot format4. Celui-ci utilise le taux d’expansion d’un plasmide de proie particulière en tant que proxy pour la force relative de Y2H interaction9. Séquençage en profondeur de tous les plasmides au sein d’une population soumise à une croissance normale ou des conditions de croissance sélective produit une carte complète de clones qui donnent des interactions Y2H fortes et faibles. Le répertoire d’interacteurs pouvant être obtenu et directement comparé à travers plusieurs plasmides d’appât. Le flux de travail qui en résulte, appelé DEEPN (dynamique d’enrichissement pour les réseaux d’évaluation des protéines) permet ainsi d’identifier les interactomes différentiels des bibliothèques proies même d’identifier des protéines, permettant la comparaison entre une protéine contre un autre.
Ici, nous démontrons DEEPN et introduire des améliorations dans les méthodes de laboratoire qui facilitent son utilisation, qui sont décrites dans la Figure 1. Des améliorations notables incluent :
Génération de populations de levures proies. Une des exigences clés de DEEPN génère des populations de levure avec des appâts différents plasmides qui ont la même distribution des bibliothèques de proies du plasmide. Les populations de base équivalent de la bibliothèque de plasmide de proies sont essentielles pour faire des comparaisons précises entre les interactomes des appâts différents. C’est plus facilement atteintes qu’un plasmide de bibliothèque occupe déjà une population de levure haploïde et pénétrant un plasmide d’appât donné de cette population est obtenue par croisement pour produire une plante diploïde. Ici, nous fournissons un guide clair dans Comment faire de ces populations en utilisant les librairies commerciales logés chez la levure haploïde. Bien que nous avons trouvé des méthodes qui génèrent un grand nombre d’espèces diploïdes, l’efficacité globale d’accouplement de ces souches de levures commerciales bibliothèque contenant était faible. Par conséquent, nous avons construit une nouvelle souche qui peut accueillir des bibliothèques de la proie qui donne beaucoup plus de diploïdes par réaction d’accouplement.
New jeu de plasmides d’appât. Plusieurs actuelles plasmides exprimant des protéines de fusion « appât » composés de la protéine d’intérêt et un domaine de liaison à l’ADN sont axés sur les 2µ, leur permettant d’amplifier leur nombre de copies. Ce nombre de copies peut être assez variable dans la population et mener à la variabilité de la réponse transcriptionnelle Y2H. Cela pourrait à son tour incliner la capacité de mesurer la force de l’interaction protéine donnée basée sur la réaction de la croissance des cellules sous sélection. Cela peut être en partie adresse à l’aide d’un plasmide de faibles copies, dont certains ont été décrits précédemment tels que le pDEST32 disponible dans le commerce10. Nous avons construit un nouveau plasmide d’appât (pTEF-GBD) qui produit des protéines de fusion Gal4-DNA-binding domain dans un plasmide d’axée sur les centromères faible copie TRP1 porteuses du gène de résistance Kanr qui permet aussi de clonage de fragments d’appâts les deux en amont et en aval du domaine de liaison à l’ADN de Gal4.
Bibliothèque de fragment nouveau High-Density Y2H. Nous avons construit un nouveau plasmide aux bibliothèques de proies Y2H maison et utilisé pour construire une bibliothèque Y2H hautement complexe, faite de fragments cisaillés au hasard de l’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae. Le séquençage a révélé que cette bibliothèque plus 1 million de différents éléments, beaucoup plus complexes que la levure décrite précédemment Y2H génomique plasmidique de bibliothèques11. Avec cette nouvelle bibliothèque, nous avons pu montrer que le flux de travail DEEPN est assez robuste pour accueillir des bibliothèques complexes avec plusieurs plasmides différents de manière fiable et reproductible.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>deep sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-HA antibodies</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>901514</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal anti-myc antibodies</td>
			<td>QED Biosciences Inc</td>
			<td>18826</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NarI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0191S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>U2211-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td>
			<td>50-948-286</td>
			<td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>K22000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td>used for making DNA agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>155256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Sodium Salt</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>E57020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Leu-Met</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Met</td>
			<td>Bio 101, Inc</td>
			<td>4520-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>used for making media plates in section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4 Triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoehanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>U20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0492-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyper Prep kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK8500</td>
			<td>preparation kit for deep sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>http://www.jcat.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlocks</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strings</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td>
			<td>EPOCH Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E220</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td>high performance ultra-sonicator in section 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;- CGGTCTT 
			CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GAGTAACG 
			ACATTCCCAGTTGTTC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-CACCGTAT 
			TTCTGCCACCTCTTCC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GCAACCGC 
			ACTATTTGGAGCGCTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide 5&#8217;-GTTCCGATG 
			CCTCTGCGAGTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-GCACATGCT 
			AGCGTCAAATACC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-ACCCAAGCA 
			GTGGTATCAACG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;- TATTTAGA 
			AGTGTCAACAACGTA -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ69-4A MatA yeast strain</td>
			<td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436</td>
			<td></td>
			<td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTEF-GBD</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLY5725 MATalpha yeast strain</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>MATalpha his3&#8710;1 leu2&#8710;0 lys2&#8710;0 ura3&#8710;0 gal4&#8710; trp1&#8710; Gal80&#8710;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGal4AD (pPL6343)</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-activation domain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>Kord-Vallmark sold by VWR</td>
			<td>2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X 150 mm Disposable Culture Tube</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Griffin Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-572-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 190</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>used to measure the Optical Density of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Spectrophotometer used to quantify amount of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic UV transilluminator</td>
			<td>Ultra Lum</td>
			<td>MEB 20</td>
			<td>used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123600G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F144802G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1236-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;LLow Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L XL Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>TC9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318949-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>5674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden applicators</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>55900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA931-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td>ECL detection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutitron 2</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630482</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630488</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGADT7 AD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630442</td>
			<td>commercially available AD Vector housing many cDNA libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630443</td>
			<td>commercially available DNA-BD Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolase DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21042</td>
			<td>DNA polymerase used for section 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-6050-60</td>
			<td>pcr machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.5 mL PCR tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions

Dépistage des interactions protéine-protéine à l’aide de l’essai 2-hybride de levure a longtemps été un outil efficace, mais son utilisation a été largement limitée à la découverte des Interactiens de haute affinité qui sont hautement enrichi dans la bibliothèque des candidats qui interagissent. Dans un format traditionnel, le dosage de 2-hybride de levure peut produire trop de colonies à analyser lorsque menée à la raideur bas où se trouvent les Interactiens faible affinité. Par ailleurs, sans un interrogatoire exhaustif et complet de la bibliothèque même contre des plasmides différents appâts, une analyse comparative ne peut être atteint. Bien que certains de ces problèmes peuvent être traités à l’aide de bibliothèques en proie, le coût et l’infrastructure nécessaire pour faire fonctionner ces écrans peuvent être prohibitifs. Comme alternative, nous avons adapté le test 2-hybride de levure pour découvrir en même temps des dizaines de transitoire et interactions de protéine statique au sein d’un seul écran utilisant une stratégie appelée DEEPN (enrichissement dynamique pour réseaux d’évaluation des protéines), qui incorpore le séquençage à haut débit et calcul de suivre l’évolution d’une population de plasmides codant les partenaires qui interagissent. Nous décrivons ici personnalisées réactifs et protocoles qui permettent un écran DEEPN à exécuter facilement et à moindre coût.

Le dosage Y2H a été largement utilisé pour trouver des interactions de protéine : protéine et plusieurs adaptations et systèmes ont été développés. Pour l’essentiel, les mêmes considérations qui aident à assurer le succès de ces approches précédentes sont importantes pour DEEPN. Parmi les critères importants : assurer l’expression du domaine de liaison à l’ADN des protéines de fusion, un faible bruit de fond des rayonnements non essentiels à assurer son + crois...

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

Traitement par lots des écrans 2-hybride de levure permet une comparaison directe des profils interaction de plusieurs protéines d’appât avec un ensemble très complexe de protéines de fusion de proies. Nous décrivons ici des méthodes raffinées, nouveaux réactifs et comment mettre en œuvre leur utilisation pour ces écrans.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Recherche

Biochimie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

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