Name: a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00
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हम NGS पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए मानव आनुवंशिकी के संस्थान के भीतर कर्मचारियों को धन्यवाद । हम Y2H प्लाज्मिड पुस्तकालय के लिए जीनोमिक पुस्तकालय टुकड़े तैयार करने में उसकी विशेषज्ञता के लिए Einat Snir धंयवाद यहां बनाया । इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था: NIH R21 EB021870-01A1 और द्वारा NSF अनुसंधान परियोजना अनुदान: १५१७११० ।

1. मीडिया और प्लेट की तैयारी
नोट: सभी प्लेटें प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले ंयूनतम 2 दिन किए जाने की जरूरत है । मीडिया किसी भी बिंदु पर बनाया जा सकता है । हालांकि, बफर खमीर निकालने peptone डेक्सट्रोज adenine ...

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+two-hybrid+assay:+still+finding+connections+after+25+years.">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Rajagopala, S. 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Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li><li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases.">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li></ol>

यहां हम कैसे बैच में Y2H परख प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित तरीकों का उपयोग करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं । वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया में मदद करने के लिए सुनिश्चित करें कि खमीर कि चयन के तहत र?...

सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक पूरी समझ प्रोटीन संपर्क नेटवर्क है कि उनके आणविक तंत्र आबाद खोजने पर निर्भर करता है । एक दृष्टिकोण प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए खमीर 2-संकर (Y2H) परख, जो एक कार्य chimeric प्रतिलेखन कारक कोडांतरण द्वारा काम करता है एक बार दो एक दूसरे के लिए ब्याज बांध के प्रोटीन डोमेन है1। एक ठेठ Y2H स्क्रीन खमीर की आबादी बनाने के द्वारा किया जाता है कि घरों plasmids एक transcriptional उत्प्रेरक से जुड़े प्रोटीन बातचीत एन्कोडिंग के दोनों एक पुस्तकालय (उदा, ' शिकार ' फ्यूजन प्रोटीन) और एक दिया ' चारा ' प्रोटीन के शामिल प्लाज्मिड एक डीएनए बंधन डोमेन से जुड़े ब्याज की (उदा, Gal4 डीएनए-बंधन डोमेन है कि Gal4 के लिए बांध-ऊपर अनुक्रम को सक्रिय) । Y2H दृष्टिकोण का मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह अपेक्षाकृत आसान और सस्ती एक ठेठ नियमित आणविक जैविक काम2के लिए सुसज्जित प्रयोगशाला में आचरण है । हालांकि, जब परंपरागत रूप से प्रदर्शन किया, एक उपयोगकर्ता एक सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए चयन पर उठता है कि व्यक्तिगत कालोनियों के नमूने । यह गंभीर रूप से ' पुस्तकालय शिकार ' क्लोन है कि सर्वेक्षण किया जा सकता है की संख्या सीमा । यह समस्या जटिल है जब एक विशेष बातचीत शिकार की बहुतायत बहुत अधिक दूसरों के सापेक्ष है, कम बहुतायत शिकार plasmids से संपर्क का पता लगाने का मौका कम ।
proteome के व्यापक कवरेज में Y2H सिद्धांत का उपयोग करने के लिए एक समाधान एक मैट्रिक्स-स्वरूपित दृष्टिकोण का उपयोग है जिसमें एक सरणी ज्ञात व्यक्ति शिकार plasmids डिजिटल पूछताछ किया जा सकता है युक्त । हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण एक बुनियादी सुविधा है कि आसानी से सुलभ या व्यक्तिगत जांचकर्ताओं जो प्रोटीन या डोमेन3की एक छोटी संख्या के interactome को परिभाषित करने में रुचि रखते है के लिए लागत प्रभावी नहीं है की आवश्यकता है । इसके अलावा, बहुत जटिल शिकार पुस्तकालयों कि बातचीत प्रोटीन के कई टुकड़े सांकेतिक शब्दों में बदलना अव्यावहारिक आकार के लिए मैट्रिक्स arrays के आकार का विस्तार हो सकता है । एक विकल्प बैचों में जटिल पुस्तकालयों के साथ परख प्रदर्शन और व्यापक समानांतर उच्च प्रवाह अनुक्रमण4का उपयोग कर क्लोनों बातचीत की उपस्थिति का आकलन है. यह परख शिकार plasmids की उपस्थिति के लिए लागू किया जा सकता है कि कई कालोनियों में पैदा एक ठेठ Y2H स्वरूपित दृष्टिकोण है जिसमें खमीर कोशिकाओं फ्यूजन प्रोटीन के एक बातचीत जोड़ी आवास एक थाली5,6पर बढ़ने की अनुमति दी है का उपयोग कर । यह सामांय विचार दोनों एकाधिक चारा और शिकार घटकों की एक ही समय में7,8की क्वेरी को बढ़ाने के लिए बल दिया जा सकता है ।
फिर भी, कई जांच एक आसान अभी कुछ ' प्रोटीन ' चारा पर और अधिक ध्यान केंद्रित प्रयास की आवश्यकता है और एक संपूर्ण और अर्द्ध एक जटिल शिकार पुस्तकालय की मात्रात्मक क्वेरी से अधिक लाभ उठा सकते हैं । हम विकसित और एक दृष्टिकोण को मांय करने के लिए व्यापक पैमाने पर प्रोटीन बातचीत बैच प्रारूप में एक Y2H सिद्धांत का उपयोग कर अध्ययन4। यह Y2H बातचीत के सापेक्ष शक्ति के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में एक विशेष शिकार प्लाज्मिड के विस्तार की दर का उपयोग करता है9। एक सामान्य वृद्धि या चयनात्मक विकास की स्थिति के अधीन आबादी के भीतर सभी plasmids के गहरे अनुक्रमण क्लोन का एक पूरा नक्शा है कि मजबूत और कमजोर Y2H बातचीत उपज पैदा करता है । बातचीत की प्रदर्शनियां प्राप्त किया जा सकता है और सीधे कई चारा plasmids भर की तुलना में । परिणामी कार्यप्रवाह DEEPN (प्रोटीन नेटवर्क के मूल्यांकन के लिए गतिशील संवर्धन) इस प्रकार एक ही शिकार पुस्तकालयों से अंतर interactomes की पहचान करने के लिए प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक प्रोटीन बनाम एक और के बीच तुलना की अनुमति ।
यहां, हम प्रदर्शन DEEPN और प्रयोगशाला तरीकों में सुधार का परिचय है कि इसके उपयोग की सुविधा है, जो चित्रा 1में उल्लिखित हैं । महत्वपूर्ण सुधार शामिल हैं:
शिकार खमीर आबादी की पीढ़ी । DEEPN की प्रमुख आवश्यकताओं में से एक अलग चारा plasmids कि प्लाज्मिड शिकार पुस्तकालयों का ही वितरण किया है के साथ खमीर की आबादी पैदा कर रहा है । शिकार प्लाज्मिड पुस्तकालय के समकक्ष आधारभूत आबादी अलग चारा के interactomes के बीच सटीक तुलना करने के लिए आवश्यक हैं । यह सबसे अच्छा है जब एक पुस्तकालय प्लाज्मिड पहले से ही एक अगुणित खमीर जनसंख्या में स्थित है और उस आबादी में एक दिया चारा प्लाज्मिड जा रहा है प्राप्त संभोग द्वारा प्राप्त की है एक द्विगुणित उपज है । यहां, हम कैसे ऐसी आबादी वाणिज्यिक अगुणित खमीर में स्थित पुस्तकालयों का उपयोग कर बनाने के लिए में एक स्पष्ट मार्गदर्शन प्रदान करते हैं । हालांकि हम तरीकों कि diploids की एक उच्च संख्या उत्पंन पाया, इन वाणिज्यिक पुस्तकालय के समग्र संभोग दक्षता युक्त खमीर उपभेदों कम था । इसलिए, हम एक नया तनाव है कि शिकार पुस्तकालयों घर कर सकते है कि पैदावार संभोग प्रतिक्रिया प्रति अधिक diploids का निर्माण किया ।
चारा plasmids का नया सेट। कई मौजूदा plasmids कि एक्सप्रेस ' चारा ' फ्यूजन प्रोटीन ब्याज और एक डीएनए-बाध्यकारी डोमेन के प्रोटीन के शामिल 2 µ आधारित हैं, उंहें अपने प्रति संख्या बढ़ाना करने की अनुमति । इस प्रति संख्या जनसंख्या में काफी चर सकता है और Y2H transcriptional प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह बदले में एक दिया प्रोटीन चयन के तहत कोशिकाओं के विकास की प्रतिक्रिया के आधार पर बातचीत की ताकत गेज करने की क्षमता विषम सकता है । यह एक कम प्रति प्लाज्मिड का उपयोग करके आंशिक रूप से पता किया जा सकता है, जिनमें से कुछ पहले ऐसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pDEST3210के रूप में वर्णित किया गया है । हम एक नया चारा प्लाज्मिड (pTEF-GBD) है कि Gal4-डीएनए-एक TRP1 centromere के भीतर डोमेन फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन प्लाज्मिड प्रतिरोध जीन है कि यह भी चारा की क्लोनिंग की अनुमति देता है ले Kanr आधारित निर्माण दोनों ऊपर और Gal4 डीएनए के बहाव-बाध्यकारी डोमेन ।
नई उच्च घनत्व Y2H टुकड़ा पुस्तकालय । हम घर Y2H शिकार पुस्तकालयों के लिए एक नया प्लाज्मिड का निर्माण किया और यह एक उच्च जटिल Y2H Saccharomyces cerevisiaeसे जीनोमिक डीएनए के बेतरतीब ढंग से कतरनी टुकड़े से बना पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए उपयोग । अनुक्रम विश्लेषण से पता चला कि इस पुस्तकालय १,०००,००० विभिन्न तत्वों पर था, कहीं अधिक जटिल पहले से वर्णित खमीर जीनोमिक Y2H प्लाज्मिड पुस्तकालयों11. इस नए पुस्तकालय के साथ, हम दिखाने के लिए कि DEEPN कार्यप्रवाह काफी मजबूत है एक तरह से है कि विश्वसनीय और reproducible है में कई अलग plasmids के साथ जटिल पुस्तकालयों को समायोजित करने में सक्षम थे ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>deep sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-HA antibodies</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>901514</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal anti-myc antibodies</td>
			<td>QED Biosciences Inc</td>
			<td>18826</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NarI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0191S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>U2211-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td>
			<td>50-948-286</td>
			<td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>K22000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td>used for making DNA agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>155256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Sodium Salt</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>E57020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Leu-Met</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Met</td>
			<td>Bio 101, Inc</td>
			<td>4520-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>used for making media plates in section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4 Triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoehanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>U20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0492-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyper Prep kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK8500</td>
			<td>preparation kit for deep sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>http://www.jcat.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlocks</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strings</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td>
			<td>EPOCH Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E220</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td>high performance ultra-sonicator in section 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;- CGGTCTT 
			CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GAGTAACG 
			ACATTCCCAGTTGTTC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-CACCGTAT 
			TTCTGCCACCTCTTCC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GCAACCGC 
			ACTATTTGGAGCGCTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide 5&#8217;-GTTCCGATG 
			CCTCTGCGAGTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-GCACATGCT 
			AGCGTCAAATACC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-ACCCAAGCA 
			GTGGTATCAACG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;- TATTTAGA 
			AGTGTCAACAACGTA -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ69-4A MatA yeast strain</td>
			<td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436</td>
			<td></td>
			<td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTEF-GBD</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLY5725 MATalpha yeast strain</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>MATalpha his3&#8710;1 leu2&#8710;0 lys2&#8710;0 ura3&#8710;0 gal4&#8710; trp1&#8710; Gal80&#8710;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGal4AD (pPL6343)</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-activation domain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>Kord-Vallmark sold by VWR</td>
			<td>2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X 150 mm Disposable Culture Tube</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Griffin Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-572-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 190</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>used to measure the Optical Density of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Spectrophotometer used to quantify amount of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic UV transilluminator</td>
			<td>Ultra Lum</td>
			<td>MEB 20</td>
			<td>used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123600G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F144802G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1236-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;LLow Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L XL Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>TC9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318949-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>5674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden applicators</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>55900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA931-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td>ECL detection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutitron 2</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630482</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630488</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGADT7 AD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630442</td>
			<td>commercially available AD Vector housing many cDNA libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630443</td>
			<td>commercially available DNA-BD Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolase DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21042</td>
			<td>DNA polymerase used for section 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-6050-60</td>
			<td>pcr machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.5 mL PCR tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions

प्रोटीन के लिए स्क्रीनिंग-प्रोटीन बातचीत खमीर 2 का उपयोग-संकर परख लंबे समय से एक प्रभावी उपकरण किया गया है, लेकिन इसके उपयोग मुख्यतः उच्च संबंध है कि अत्यधिक बातचीत उंमीदवारों के पुस्तकालय में समृद्ध कर रहे है की खोज के लिए सीमित किया गया है । एक पारंपरिक स्वरूप में, खमीर 2-संकर परख भी कई कालोनियों उपज के लिए विश्लेषण कर सकते है जब कम stringency में आयोजित किया, जहां कम संबंध के संपर्क में पाया जा सकता है । इसके अलावा, अलग चारा plasmids के खिलाफ एक ही पुस्तकालय के एक व्यापक और पूर्ण पूछताछ के बिना, एक तुलनात्मक विश्लेषण प्राप्त नहीं किया जा सकता है । हालांकि इन समस्याओं के कुछ सरणी शिकार पुस्तकालयों का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है, लागत और ऐसी स्क्रीन संचालित करने के लिए आवश्यक बुनियादी सुविधाओं के निषेध किया जा सकता है । एक विकल्प के रूप में, हम खमीर अनुकूलित किया है 2-संकर परख के लिए एक ही एक स्क्रीन एक रणनीति का उपयोग DEEPN (प्रोटीन नेटवर्क के मूल्यांकन के लिए गतिशील संवर्धन) के भीतर परिवर्तनीय और स्थैतिक प्रोटीन बातचीत के दर्जनों उजागर करने के लिए, जो उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण और गणना शामिल plasmids की आबादी के विकास का पालन करने के लिए कि सांकेतिक शब्दों में बदलना भागीदारों । यहाँ, हम अनुकूलित रिएजेंट और प्रोटोकॉल है कि एक DEEPN स्क्रीन आसानी से और लागत प्रभावी ढंग से क्रियान्वित करने की अनुमति का वर्णन.

प्रोटीन बातचीत और कई रूपांतरों और प्रणालियों विकसित किया गया है: Y2H परख व्यापक रूप से प्रोटीन खोजने के लिए इस्तेमाल किया गया है । अधिकांश भाग के लिए, एक ही विचार है कि इन पिछले दृष्टिकोण के सा...

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

एक खमीर 2-बैच में संकर स्क्रीन प्रोटीन बातचीत की तुलना करने के लिए

2 खमीर के बैच प्रसंस्करण-संकर स्क्रीन शिकार फ्यूजन प्रोटीन का एक अत्यधिक जटिल सेट के साथ कई चारा प्रोटीन की बातचीत प्रोफाइल की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है । यहां, हम परिष्कृत तरीकों, नए रिएजेंट का वर्णन है, और कैसे ऐसी स्क्रीन के लिए उनके उपयोग को लागू करने के लिए ।

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

एक उपकरण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रतिदीप्ति एनिसोट्रॉपिक

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

हिेटोमोमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स-डीएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए संशोधित खमीर-एक हाइब्रिड सिस्टम

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स Intracellular प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Proteolytic गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए एक Fluorogenic पेप्टाइड दरार परख: कोरोनावायरस कील प्रोटीन सक्रियण के लिए आवेदन

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए वीवो हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग में

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...