Name: a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00
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우리 직원을 내에서 연구소의 인간 유전학 NGS 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 감사합니다. 여기 Y2H 플라스 미드 도서관에 대 한 게놈 라이브러리 조각 준비에 그녀의 전문성에 감사 Einat Snir 하 고. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다: NIH R21 EB021870-01A1 NSF 연구 프로젝트 그랜트에 의해: 1517110.

1입니다. 미디어와 접시의 준비
참고: 모든 접시 프로토콜을 시작 하기 전에 2 일 최소로 만들 필요가 있다. 미디어는 언제 든 지 할 수 있다. 그러나, 버퍼링 된 효 모 추출 물 펩 포도 당 아데닌 (bYPDA) 사용 되는 날을 만들 수 필요가 있다. 일부 미디어 무엇 일반적으로 사용 되는 보다 큰 아데닌의 수준을 포함 하는 보충 믹스를 사용 하 여 이루어집니다. 대부분 최소한의 미디어 ...

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+two-hybrid+assay:+still+finding+connections+after+25+years.">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Rajagopala, S. 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여기 우리는 최적화 된 방법을 사용 하 여 일괄 처리에서 Y2H 분석 실험을 수행 하는 방법에 대 한 가이드를 제공 합니다. 선택 아래에 배치 될 것 이다 효 모의 인구 시작 라이브러리의 대표는 하 고 충분히 시작 효 모 인구 다양성을 제한 하는 선택을 사용 하는 절차에 있는 몇 가지 중요 한 단계 . 중요 한 것은, 이러한 벤치 마크는 적응 방법 및 전통적인 Y2H 분석 결과, 따라서이 방법은 대부분 실?...

세포 생물학 과정의 완전 한 이해를 찾는 그들의 분자 메커니즘의 기반이 되는 단백질 상호 작용 네트워크에 의존 합니다. 단백질 상호 작용을 식별 하는 한 가지 방법은 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과, 관심의 두 단백질 도메인 바인딩할 다른1일단 작동 공상 전사 요소를 조립 하 여 작동 하는. 전형적인 Y2H 화면 인코딩 상호 작용 단백질에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 플라스 미드의 두 도서관 효의 인구를 생성 하 여 수행 됩니다 (예., '먹이' 퓨전 단백질)와 주어진된 '미끼' 플라스 미드 단백질의 구성 관심사의 DNA 바인딩 도메인 (예를 들면,에 Gal4 상류 활성화 순서 Gal4 DNA 바인딩 도메인)에 융합. Y2H 접근의 주요 장점 중 하나 그것은 상대적으로 쉽게 하 고 일상적인 분자 생물학 작업2에 대 한 일반적인 실험실에서 수행 하는 저렴 한 장비입니다. 그러나 때 전통적으로 수행, 사용자 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 사항에 따라 발생 하는 개별 식민지를 샘플링 합니다. 이 심각 하 게 조사 될 수 있는 라이브러리 '먹이' 클론의 수를 제한 합니다. 이 문제는 때 특정 상호 작용 먹이의 풍부한 매우 낮은 풍부한 먹이 플라스 미드에서 상호 작용 검출의 기회를 감소, 다른 기준으로 복합입니다.
Y2H 원리는 프로테옴의 포괄적인 범위에서 사용 하기 위한 하나의 솔루션 알려진된 개별 먹이 플라스 미드를 포함 하는 배열을 디지털 심문 될 수 있습니다 어떤 점에서 매트릭스 형식의 접근 방법의 사용 이다. 그러나, 이러한 접근 되지 않는 쉽게 액세스할 수 또는 비용 효율적인 단백질 또는 도메인3의 적은 수의 위하여 정의에 관심이 개별 조사 하는 인프라가 필요 합니다. 또한, 상호 작용 단백질의 여러 단편을 인코딩할 수 있습니다 매우 복잡 한 먹이 라이브러리 것 허무 크기 같은 매트릭스 배열의 크기를 확장 합니다. 대안은 배치에서 복잡 한 라이브러리와 분석을 수행 하 고 대규모 병렬 높 처리량 연속4를 사용 하 여 상호 작용 클론의 존재를 평가 하는 것 이다. 이 일반적인 사용 하 여 여러 식민지에서 발생 하는 먹이 플라스 미드의 존재를 시험에 적용할 수 있는 Y2H 형식의 접근을 효 모에 세포 융해 단백질의 상호 작용 쌍 주택 접시5,6에 성장 수 있습니다. 이 일반적인 생각 쿼리 두 여러 미끼의 증가 먹이 같은 시간7,8에서 구성 요소를 강조 될 수 있습니다.
아직도, 많은 조사 쉽게 아직 더에 초점을 맞춘 노력 불과 단백질 '미끼'를 요구 하 고 단일 복잡 한 먹이 라이브러리의 완전 및 반 정량적 쿼리에서 더 혜택을 받을 수 있습니다. 우리가 개발 하 고 배치 형식4의 Y2H 원리를 사용 하 여 대규모 단백질 상호 작용 연구를 수행 하는 방법을 확인 했습니다. 이 Y2H 상호 작용9의 상대 강도 대 한 프록시는 특정 먹이 플라스 미드의 확장 속도 사용합니다. 인구 내의 모든 플라스 미드의 깊은 시퀀싱 대상이 정상적인 성장 또는 선택적 성장 조건 강하고 약한 Y2H 상호 작용을 생성 하는 클론의 완전 한 지도 생성. 인터의 레 퍼 토리 얻을 하 고 직접 여러 미끼 플라스 미드에 걸쳐 비교 수 있습니다. 불리 DEEPN (동적 농축 단백질 네트워크의 평가) 결과 워크플로 따라서 다른에 대 한 단백질 사이 비교를 허용 하는 단백질을 식별 하기 위해 같은 먹이 라이브러리에서 차동 interactomes 식별 하 사용할 수 있습니다.
여기, 우리가 DEEPN 설명 그림 1에 설명 되어 있습니다 실험실 방법의 사용을 촉진 하는 개선 사항 소개. 중요 한 개선 다음과 같습니다.
먹이 효 모 인구의 세대. DEEPN의 주요 요구 사항 중 하나 다른 미끼 플라스 미드 플라스 미드 먹이 라이브러리의 동일한 분포와 누 룩의 생성 합니다. 등가 기준 인구 먹이 플라스 미드 도서관의 다른 미끼의 interactomes 간의 정확한 비교를 만들기 위한 필수적입니다. 이것은 최고의 도서관 플라스 미드는 이미 단일 효 모 인구에 자리 하 고는 2 중 생산 짝짓기에 의해 달성 된다 인구에 주어진된 미끼 플라스 미드 이동 달성. 여기, 우리는 단일 효 모에는 상용 라이브러리를 사용 하 여 이러한 인구를 확인 하는 방법에 명확한 가이드를 제공 합니다. 우리가 diploids의 높은 번호를 생성 하는 방법을 발견, 이러한 상용 라이브러리-포함 된 효 모 종자의 전반적인 짝짓기 효율 낮은 했다. 따라서, 우리는 짝짓기 반응 당 훨씬 더 많은 diploids 수율 먹이 라이브러리를 집을 수 있습니다 새로운 긴장을 건설 한다.
새로운 미끼 플라스 미드의 설정. 익스프레스 '미끼' 퓨전 단백질 구성 관심과 DNA 바인딩 도메인의 단백질의 많은 현재 플라스 미드 2µ-기반으로, 그들의 복사본 수를 증폭 하는. 이 복사 번호 인구에서 매우 변수 하 고 Y2H transcriptional 응답에서 가변성으로 이어질 수 있습니다. 이 차례로 선택 셀의 성장 응답에 따라 주어진된 단백질 상호 작용의 강도 측정 하는 기능을 왜곡 수 있습니다. 이 중 일부는 이전 상용 pDEST3210같은 설명 되었습니다 낮은 사본 플라스 미드를 사용 하 여 주소 분할 수 있습니다. 우리가 건설 한 새로운 미끼 플라스 미드 (pTEF GBD) 또한 상류의 미끼 조각 모두 복제 수 있습니다 Kanr 저항 유전자를 운반 TRP1 centromere 기반 낮은 사본 플라스 미드 내 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질을 생산 하 고 Gal4 DNA 바인딩 도메인의 다운스트림.
새로운 고밀도 Y2H 조각 도서관. 우리 집 Y2H 먹이 라이브러리에 새로운 플라스 미드를 건설 하 고 게놈 DNA의 임의로 깎인된 파편의 Saccharomyces cerevisiae에서 만든 매우 복잡 한 Y2H 라이브러리를 구축 하는 데 사용. 시퀀스 분석이 라이브러리 1 백만 이상 다른 요소, 앞에서 설명한 효 모 게놈 Y2H 플라스 미드 도서관11보다 훨씬 더 복잡 했다 보여주었다. 이 새로운 라이브러리 DEEPN 워크플로 안정적이 고 재현 가능한 방식으로 많은 다른 플라스 미드와 복잡 한 라이브러리에 맞게 충분히 강력한 보여줄 수 있었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>deep sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-HA antibodies</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>901514</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal anti-myc antibodies</td>
			<td>QED Biosciences Inc</td>
			<td>18826</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NarI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0191S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>U2211-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td>
			<td>50-948-286</td>
			<td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>K22000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td>used for making DNA agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>155256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Sodium Salt</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>E57020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Leu-Met</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Met</td>
			<td>Bio 101, Inc</td>
			<td>4520-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>used for making media plates in section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4 Triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoehanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>U20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0492-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyper Prep kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK8500</td>
			<td>preparation kit for deep sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>http://www.jcat.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlocks</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strings</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td>
			<td>EPOCH Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E220</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td>high performance ultra-sonicator in section 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;- CGGTCTT 
			CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GAGTAACG 
			ACATTCCCAGTTGTTC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-CACCGTAT 
			TTCTGCCACCTCTTCC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GCAACCGC 
			ACTATTTGGAGCGCTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide 5&#8217;-GTTCCGATG 
			CCTCTGCGAGTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-GCACATGCT 
			AGCGTCAAATACC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-ACCCAAGCA 
			GTGGTATCAACG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;- TATTTAGA 
			AGTGTCAACAACGTA -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ69-4A MatA yeast strain</td>
			<td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436</td>
			<td></td>
			<td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTEF-GBD</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLY5725 MATalpha yeast strain</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>MATalpha his3&#8710;1 leu2&#8710;0 lys2&#8710;0 ura3&#8710;0 gal4&#8710; trp1&#8710; Gal80&#8710;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGal4AD (pPL6343)</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-activation domain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>Kord-Vallmark sold by VWR</td>
			<td>2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X 150 mm Disposable Culture Tube</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Griffin Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-572-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 190</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>used to measure the Optical Density of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Spectrophotometer used to quantify amount of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic UV transilluminator</td>
			<td>Ultra Lum</td>
			<td>MEB 20</td>
			<td>used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123600G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F144802G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1236-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;LLow Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L XL Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>TC9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318949-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>5674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden applicators</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>55900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA931-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td>ECL detection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutitron 2</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630482</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630488</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGADT7 AD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630442</td>
			<td>commercially available AD Vector housing many cDNA libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630443</td>
			<td>commercially available DNA-BD Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolase DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21042</td>
			<td>DNA polymerase used for section 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-6050-60</td>
			<td>pcr machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.5 mL PCR tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions

효 모 2 잡종 분석 결과 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 심사는 긴 효과적인 도구, 하지만 사용 크게 상호 작용 후보자의 라이브러리에서 풍성 하 게 매우 높은 선호도 인터의 발견에 제한 되었습니다. 전통적인 형식에서 효 모 2 잡종 분석 결과 분석 낮은 엄중에서 실시 하는 경우에 낮은 선호도 인터를 찾을 수 있습니다 너무 많은 식민지를 얻을 수 있습니다. 또한, 다른 미끼 플라스 미드에 대 한 동일한 라이브러리의 포괄적이 고 완전 한 심문 없이 비교 분석 얻을 수 없다. 이러한 문제 중 일부 기준점과 먹이 라이브러리를 사용 하 여 해결할 수 있습니다, 있지만 비용과 같은 화면을 작동 하는 데 필요한 인프라는 금지 될 수 있습니다. 대신, 우리 동시에 과도의 수십을 밝히기 위해 효 모 2 잡종 분석 결과 적응 및 정적 단백질 상호 작용 전략을 활용 한 화면 내에서 불리 DEEPN (평가의 단백질 네트워크를 위한 동적 농축)을 통합 높 처리량 DNA 연속 그리고 상호 작용 파트너 인코딩할 플라스 미드의 인구의 진화에 따라 계산 합니다. 여기, 우리 사용자 지정된 시 약 및 DEEPN 화면 쉽고 비용 효율적으로 실행 될 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

Y2H 분석 결과 단백질: 단백질 상호 작용을 찾기위한 널리 사용 되었습니다 그리고 몇 가지 적응 및 시스템 개발 되었습니다. 대부분의 경우, 이러한 이전 접근의 성공을 보장 하는 데 도움이 같은 고려 DEEPN에 대 한 중요 하다. 중요 한 벤치 마크의 일부를 포함: 보장 표현의 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질, 보장의 스 퓨 리 어스 낮은 배경을 포함 하는 빈 먹이 플라스 미드, ?...

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

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Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...