Name: a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00
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Agradecemos al personal en el Instituto de genética humana para secuenciación y NGS biblioteca preparación. Damos las gracias por su experiencia en la preparación de fragmentos de la biblioteca genómica de la biblioteca de plásmido Y2H aquí Einat Snir. Este trabajo fue financiado por National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 y beca de proyecto de investigación NSF: 1517110.

1. preparación de medios de comunicación y placas
Nota: Todas las placas deben ser mínimamente 2 días antes de comenzar el protocolo. Los medios de comunicación se pueden hacer en cualquier momento. Sin embargo, la adenina de dextrosa de peptona de extracto de levadura protegido (bYPDA) debe hacerse el día que se utilizará. Algunos medios de comunicación se realiza mediante una combinación de suplemento que contiene un nivel de adenina que es más grande que lo que se suele utilizar. M?...

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Aquí ofrecemos a una guía de cómo llevar a cabo ensayos de Y2H en lote usando métodos optimizados. Hay algunos pasos críticos en el procedimiento para garantizar que la población de levaduras que se colocaba en la selección es representante de la biblioteca de partida y que suficiente de la población a partir de la levadura se utiliza para someterse a la selección para limitar la variabilidad . Lo importante, estos criterios son relativamente fáciles de lograr junto a adaptar los métodos y materiales para un e...

Una comprensión completa de los procesos biológicos de la célula se basa en la búsqueda de las redes de interacción de proteínas que subyacen sus mecanismos moleculares. Un enfoque para identificar las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que trabaja montando un factor de transcripción quimérica de funcionamiento una vez que dos dominios de la proteína de interés unen unos a otros1. Una típica pantalla de Y2H se realiza mediante la creación de una población de levaduras que alberga tanto una biblioteca de plásmidos que codifican las proteínas interactúan con fusible para un activador transcripcional (ej., proteína de la fusión de presas) y un plásmido determinado 'cebo' compuesta por la proteína de interés fusionado a un dominio de unión a ADN (por ejemplo, el dominio de Gal4 DNA-que atan que se une a la secuencia de activación Gal4-upstream). Una de las principales ventajas del enfoque Y2H es que es relativamente fácil y barato para llevar a cabo en un laboratorio típico equipado para trabajo biológico molecular de rutina2. Sin embargo, cuando tradicionalmente se realiza, un usuario muestras de colonias individuales que surgen en la selección para una interacción positiva de Y2H. Seriamente, esto limita el número de clones 'presa' de biblioteca que puede ser examinado. Este problema se agrava cuando la abundancia de una presa particular de interacción es muy alta en relación con los demás, disminuyendo la posibilidad de detectar la interacción de plásmidos de presas de baja abundancia.
Una solución para usar el principio de Y2H en cobertura del proteoma es el uso de un enfoque con formato de matriz en una matriz que contiene plásmidos conocido presa individual puede ser interrogada digitalmente. Sin embargo, este enfoque requiere una infraestructura que no es fácilmente accesible o rentable a investigadores individuales que estén interesados en definir el interactoma de un pequeño número de proteínas o dominios3. Además, bibliotecas de presa muy complejo que pueden codificar múltiples fragmentos de proteínas interactuantes ampliaría el tamaño de tales matrices matriz tamaño práctico. Una alternativa es realizar ensayos con complejo bibliotecas en lotes y evaluar la presencia de clones interactúan mediante secuenciación masiva en paralelo alto rendimiento4. Esto puede aplicarse para analizar la presencia de plásmidos de presas que se presentan en varias colonias con un típico Y2H formato enfoque en cual levadura las células vivienda un par de interacción de proteínas de fusión pueden crecer en una placa de5,6. Esta idea general se puede acentuarse para aumentar la consulta de ambos múltiples cebo y presa de componentes en el mismo tiempo7,8.
Sin embargo, muchas investigaciones requieren que un más fácil todavía centra más esfuerzo en pocos proteína 'cebos' y pueden beneficiarse más de una consulta exhaustiva y semi-cuantitativa de una sola presa complejo biblioteca. Hemos desarrollado y validado un método para llevar a cabo estudios de interacción de proteínas de gran escala usando un principio Y2H en lote formato4. Esto utiliza la tasa de expansión de un plásmido determinado presa como un proxy para la fuerza relativa de Y2H interacción9. Profundo secuenciación de los plásmidos dentro de una población sometida a un crecimiento normal o las condiciones de crecimiento selectivo produce un mapa completo de clones que producen interacciones de Y2H fuertes y débiles. El repertorio de interactianos puede ser obtenido y comparado directamente a través de múltiples plásmidos de cebo. El flujo resultante denominado DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas) así puede utilizarse para identificar interactomes diferencial de las mismas bibliotecas de presa para identificar proteínas, permitiendo la comparación entre una proteína y otra.
Aquí, demostramos DEEPN e introducir mejoras en los métodos de laboratorio que facilitan su uso, que se detallan en la figura 1. Las mejoras significativas incluyen:
Generación de las poblaciones de levadura presas. Uno de los requisitos clave de DEEPN está generando poblaciones de levaduras con cebo diferentes plásmidos que tienen la misma distribución de las bibliotecas de la presa de plásmido. Poblaciones de referencia equivalente de la biblioteca de plásmido de presa son esenciales para hacer comparaciones exactas entre los interactomes de diferentes cebos. Esto se logra mejor cuando un plásmido de biblioteca ya se encuentra en una población de levadura haploide y mover un plásmido determinado cebo en que la población se consigue por el apareamiento para producir un diploide. Aquí, ofrecemos a una guía clara de cómo hacer estas poblaciones usando librerías comerciales ubicados en levadura haploide. Aunque hemos encontrado métodos que generan un alto número de diploides, la eficiencia global de apareamiento de estas cepas de levadura que contiene la biblioteca comercial fue baja. Por lo tanto, construimos una nueva cepa que puede albergar bibliotecas presa que cede más diploides por reacción de acoplamiento.
Nuevo sistema de plásmidos de cebo. Muchos plásmidos actuales que expresan proteínas de la fusión de la 'carnada' compuestas de la proteína de interés y un dominio DNA-que atan son 2µ, lo que les permite ampliar su número de copia. Este número de la copia puede ser muy variable en la población y conducir a la variabilidad en la respuesta transcripcional de Y2H. Esto a su vez podría sesgar la capacidad para medir la fuerza de una interacción de proteína determinada basada en la respuesta de crecimiento de células en la selección. Esto puede ser en parte dirección mediante el uso de un plásmido de copia baja, algunos de los cuales se han descrito previamente como el pDEST32 disponible en el mercado10. Construimos un nuevo plásmido de cebo (pTEF-GBD) que produce proteínas de fusión Gal4-Unión al ADN dominio dentro de un plásmido de copia baja basada en el centrómero de TRP1 portadores del gen de resistencia Kanr que también facilita la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba y aguas abajo del dominio de unión al ADN de Gal4.
Biblioteca de fragmento de nueva alta densidad Y2H. Había construido un nuevo plásmido a las bibliotecas de casa Y2H presa y usado para construir una biblioteca de Y2H altamente compleja hecha de esquilado al azar fragmentos de la DNA genomic de Saccharomyces cerevisiae. Análisis de la secuencia demostró que esta biblioteca tenía sobre 1 millón de diferentes elementos, mucho más complejos que descrita levadura genómica Y2H plásmido bibliotecas11. Con esta nueva biblioteca, hemos sido capaces de demostrar que el flujo de trabajo DEEPN es lo suficientemente robusto como para dar cabida a las bibliotecas del complejo con muchos plásmidos diferentes en una manera fiable y reproducible.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>deep sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-HA antibodies</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>901514</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal anti-myc antibodies</td>
			<td>QED Biosciences Inc</td>
			<td>18826</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NarI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0191S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>U2211-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td>
			<td>50-948-286</td>
			<td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>K22000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td>used for making DNA agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>155256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Sodium Salt</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>E57020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Leu-Met</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Met</td>
			<td>Bio 101, Inc</td>
			<td>4520-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>used for making media plates in section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4 Triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoehanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>U20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0492-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyper Prep kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK8500</td>
			<td>preparation kit for deep sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>http://www.jcat.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlocks</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strings</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td>
			<td>EPOCH Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E220</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td>high performance ultra-sonicator in section 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;- CGGTCTT 
			CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GAGTAACG 
			ACATTCCCAGTTGTTC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-CACCGTAT 
			TTCTGCCACCTCTTCC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GCAACCGC 
			ACTATTTGGAGCGCTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide 5&#8217;-GTTCCGATG 
			CCTCTGCGAGTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-GCACATGCT 
			AGCGTCAAATACC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-ACCCAAGCA 
			GTGGTATCAACG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;- TATTTAGA 
			AGTGTCAACAACGTA -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ69-4A MatA yeast strain</td>
			<td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436</td>
			<td></td>
			<td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTEF-GBD</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLY5725 MATalpha yeast strain</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>MATalpha his3&#8710;1 leu2&#8710;0 lys2&#8710;0 ura3&#8710;0 gal4&#8710; trp1&#8710; Gal80&#8710;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGal4AD (pPL6343)</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-activation domain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>Kord-Vallmark sold by VWR</td>
			<td>2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X 150 mm Disposable Culture Tube</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Griffin Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-572-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 190</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>used to measure the Optical Density of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Spectrophotometer used to quantify amount of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic UV transilluminator</td>
			<td>Ultra Lum</td>
			<td>MEB 20</td>
			<td>used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123600G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F144802G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1236-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;LLow Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L XL Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>TC9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318949-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>5674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden applicators</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>55900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA931-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td>ECL detection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutitron 2</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630482</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630488</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGADT7 AD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630442</td>
			<td>commercially available AD Vector housing many cDNA libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630443</td>
			<td>commercially available DNA-BD Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolase DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21042</td>
			<td>DNA polymerase used for section 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-6050-60</td>
			<td>pcr machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.5 mL PCR tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions

Detección de interacciones proteína-proteína usando el análisis de 2 híbrido de levadura ha sido una herramienta eficaz, pero su uso en gran parte se ha limitado al descubrimiento de interactianos de alta afinidad que se enriquecen altamente en la biblioteca de los candidatos interactúan. En un formato tradicional, el ensayo de 2-híbrido de la levadura puede producir también muchas colonias a analizar cuando se llevó a cabo en baja estrigencia donde podrían hallarse los interactianos de baja afinidad. Por otra parte, sin un interrogatorio amplio y completo de la misma biblioteca contra cebos diferentes plásmidos, no se puede lograr un análisis comparativo. Aunque algunos de estos problemas pueden abordarse utilizando bibliotecas de vestida de presa, el costo y la infraestructura necesaria para el funcionamiento de estas pantallas pueden ser prohibitivos. Como alternativa, hemos adaptado el ensayo 2-híbrido de levadura para descubrir al mismo tiempo decenas de transitorios y las interacciones de proteínas estáticas dentro de una sola pantalla utilizando una estrategia denominada DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas), que incorpora la secuencia de la DNA de alto rendimiento y cálculo para seguir la evolución de una población de plásmidos que codifican a socios interactúan. Aquí, describimos modificado para requisitos particulares los reactivos y protocolos que permiten una pantalla DEEPN para ejecutar fácil y rentable.

El ensayo de Y2H ha sido ampliamente utilizado para la búsqueda de las interacciones proteína: proteína y se han desarrollado varias adaptaciones y sistemas. En su mayor parte, las mismas consideraciones que ayudan a asegurar el éxito con estos métodos anteriores son importantes para DEEPN. Algunos de los puntos de referencia importantes son: garantizar la expresión de dominio DNA-obligatorio proteínas de fusión, asegurando un bajo fondo de falso crecimiento su + en los diploides ...

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Investigación

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Péptidos de penetración celular biotinilado para estudiar interacciones de proteínas intracelulares

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Un ensayo de escote de péptido fluorógenos para detectar actividad proteolítica: aplicaciones para coronavirus punto de activación de la proteína

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Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

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Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

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In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

En Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para el Estudio de Interacciones Proteicas en Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...