Name: informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens
Uploaded: 2018-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 og af NSF Research Project Grant: 1517110.

1. kortlægning Fastq filer
Bemærk: DEEPN software samt mange Bioinformatik programmer bruge DNA sekvens data hvori hver sekvens læse har kortlagt for sin holdning i reference DNA. En bred vifte af mapping programmer kan bruges til dette, herunder den MAPster grænseflade her, bruger programmet HISTAT2 til at producere .sam filer bruges i efterfølgende trin.
<ol><li>Kortdata sekvens til den korrekte version af genomet. For Y2H biblioteker af museoprindelse, bruge UCSC mm10 genom; nemlig d...

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

Software suite beskrevet her tillader en at helt behandle og analysere høj overførselshastighed DNA-sekventering data fra en DEEPN eksperiment. Det første program er MAPster, som tager DNA sekvens læsninger i standard fastq filer og maps deres position på en reference DNA for downstream behandling af en lang række edb-programmer, herunder DEEPN-software. Nytte af MAPster grænsefladen og dens evne til at stå i kø flere arbejdspladser, kombinere inputfiler, coveniently navn outputfiler, kombineret med hastigheden ...

En metode til at opdage protein interaktioner er gær 2-hybrid (Y2H) analysen, som udnytter manipuleret gærceller, som vokser kun når et protein af interesse binder sig til et fragment af en interagerende partner1. Påvisning af flere Y2H interaktioner kan nu gøres med hjælp fra massive parallelle høj overførselshastighed sekvensering. Flere formater har været beskrevet2,3,4,5 herunder en, der udviklede vi hvor befolkninger er vokset i parti under betingelser, der vælger for gær som indeholder plasmider, der producerer en positiv Y2H interaktion6. Arbejdsprocessen vi udviklet, kaldes DEEPN (dynamisk berigelse for evaluering af Protein netværk), identificerer differentieret interactomes fra de samme byttedyr biblioteker til at identificere proteiner, der interagerer med en protein (eller domæne) vs. et andet protein eller en for særskilte mutant domæne. En af de vigtigste trin i arbejdsprocessen er korrekt behandling og analyse af DNA-sekventering data. Nogle oplysninger kan udledes af bare tælle antallet af læser for hvert gen både før og efter udvælgelsen af Y2H interaktioner i en mode svarer til et RNA-seq eksperiment. Men meget mere dybdegående oplysninger kan udvindes fra disse datasæt, herunder oplysningerne på underdomænet af et bestemt protein, der er i stand til at producere en Y2H interaktion. Derudover DEEPN tilgang er værdifulde, kan analysere mange prøve replikater være besværlige og dyre. Dette problem er afhjulpet ved hjælp af en statistisk model, der blev udviklet specielt til DEEPN datasæt hvor antallet af gentagelser er begrænset6. For at gøre behandling og analyse af DNA-sekventering datasæt pålidelige, fuldstændige, robust og tilgængelige for efterforskere uden Bioinformatik ekspertise, udviklede vi en suite af programmer, der dækker alle trin af analysen.
Denne suite af stand-alone software-programmer, der kører på stationære computere omfatter MAPster, DEEPN og Stat_Maker. MAPster er en grafisk brugergrænseflade, der tillader hver fastq fil i kø for tilknytningen til genom ved hjælp af HISAT2 program7, producerer en standard .sam fil til brug i downstream applikationer. DEEPN har flere moduler. Det tildeler og tæller læser svarende til bestemt gen svarende til en RNA-seq type kvantificering ved hjælp af modulet 'Genet tæller'. Det også udtrækker de sekvenser, svarende til krydset mellem Gal4 transcriptional domæne og bytte rækkefølgen og samler placeringen af disse knudepunkter at tillade deres inspektion af komparative tabeller og grafer (ved hjælp af modulet 'Junction_Make') Modulet 'Blast_Query' giver mulighed for nem inspektion, kvantificering og sammenligning af krydset Gal4 junction sekvenser. Stat_Maker evaluerer læser per gen berigelse data statistisk som en måde at prioritere sandsynligvis Y2H hits. Vi beskriver her, hvordan til at bruge disse programmer og fuldt analysere DNA sekvens data fra en DEEPN Y2H eksperimentere. Versioner af DEEPN er tilgængelig til at køre på PC, Mac og Linux-systemer. Andre programmer, såsom kortlægning program MAPster og DEEPN statistik modul Stat_Maker stole på subrutiner, der kører under Unix og findes kun på Mac og linux-systemer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mapster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEEPN software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statmaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum computer system</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Mac Intel Core i5 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>OS 10.10 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>Intel i5-7400 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Windows 7 or higher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Vi har tilpasset gær 2-hybrid assay for at samtidig afdække snesevis af forbigående og statisk protein interaktioner indenfor en enkelt skærm udnytte høj overførselshastighed kort-Læs DNA sekvens. Den resulterende sekvens datasæt kan ikke kun spore hvad gener i en befolkning, der er beriget under markering for positive gær 2-hybrid interaktioner, men også give detaljerede oplysninger om de relevante underdomæner af proteiner tilstrækkeligt for interaktion. Her, beskriver vi en fuld suite af stand-alone-softwareprogrammer, der tillader ikke-eksperter til at udføre alle bioinformatik og statistisk skridt til at behandle og analysere DNA sekvens fastq filer fra en batch gær 2-hybrid assay. De behandlingstrin, er omfattet af disse software omfatter: 1) kortlægning og tælle sekvens læser svarende til hver kandidat protein kodet inden for en gær 2-hybrid bytte bibliotek; 2) en statistisk analyse program, der evaluerer berigelse profiler; og 3) værktøjer til at undersøge translationel ramme og position inden for regionen kodning af hver beriget plasmidet, som koder de interagerende proteiner af interesse.

Kortlægning af fastq data: det første skridt I praktisk talt alle NGS programmer herunder DEEPN den oprindelige output er en fil af kort sekvens læser, der skal tilknyttes ved tilpasning til genomisk, reference transkriptom, eller anden DNA8. For nylig, HISAT2 justering program blev udviklet som anvender state-of-the-art indekseringsalgoritmer trækker til dramatisk øge kortlægning hastighed7,<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Dyb sekventering af gær populationer valgt for positive gær 2-hybrid interaktioner potentielt giver et væld af oplysninger om interagerende partner proteiner. Her beskriver vi driften af specifikke bioinformatik værktøjer og tilpassede opdateret software til at analysere sekvens data fra sådanne skærme.

IT analyse af sekvens Data fra Batch gær 2-Hybrid skærme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transkriptom Analyse af<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA sekventering data via Tuxedo Suite på Galaxy-projektet

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tovejs Retroviral Integration Site PCR Metode og Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Forberedelse af prøver og analyser af RNASeq-baseret genekspression Data fra zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Roman sekvens opdagelsen af subtraktiv genomforskning

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Forbedret gær One-hybrid skærme til at identificere transskription faktor Binding til menneskelige DNA-sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Udforskning sekvens plads til at identificere bindende sites for regulerende RNA-bindende proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Samlede CRISPR-baserede genetiske skærme i pattedyrsceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...