Name: informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens
Uploaded: 2018-06-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 och av NSF forskning projektbidrag: 1517110.

1. kartläggning Fastq filer
Obs: DEEPN programvara samt många bioinformatik program använda DNA-sekvensdata vari varje sekvens Läs har mappats för dess position i referens DNA. En mängd kartprogram kan användas för detta inklusive MAPster gränssnittet här som använder programmet HISTAT2 för att producera .sam filer som används i efterföljande steg.
<ol><li>Mappa sekvensdata till rätt version av genomet. För Y2H bibliotek av mus ursprung, använda UCSC mm10 genomet; för dem s...

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

Den programserien som beskrivs här tillåter en att helt bearbeta och analysera hög genomströmning DNA sekvensering data från ett DEEPN experiment. Det första programmet som används är MAPster, som tar den DNA sekvens läser i standard fastq filer och kartor sin position på en referens DNA för nedströms behandling av en hel mängd informatik program inklusive DEEPN programvara. Verktyget MAPster gränssnittet och dess förmåga att köa flera jobb, kombinera indatafiler, 눇Mycket namn utdatafiler, tillsammans ...

En metod att upptäcka proteininteraktioner är jäst 2-hybrid (Y2H) analysen, som utnyttjar konstruerad jästceller som växer endast när ett protein av intresse binder till ett fragment av ett samverkande partner1. Påvisande av flera Y2H interaktioner kan nu göras med hjälp av massiva parallella hög genomströmning sekvensering. Flera format har varit beskrivs2,3,4,5 inklusive en som vi utvecklat där populationer odlas i batch villkor som väljer för jäst som innehåller plasmider som producerar en positiva Y2H interaktion6. Arbetsflödet vi utvecklat, kallas DEEPN (dynamisk anrikning för utvärdering av Protein nätverk), identifierar differential interactomes från samma prey biblioteken att identifiera proteiner som samverkar med en protein (eller domän) vs. ett annat protein eller en conformationally distinkta mutant domän. En av de största stegen i det här arbetsflödet är korrekt bearbetning och analys av DNA sekvensering data. Viss information kan härledas genom att bara räkna antalet läsningar för varje gen både före och efter markeringen av Y2H interaktioner i en mode analogt med ett RNA-seq experiment. Dock kan mycket mer ingående information utvinnas ur dessa datamängder inklusive information om underdomänen av ett visst protein som är kapabel att producera en Y2H interaktion. Den DEEPN metoden är värdefull, kan analysera många prov replikat dessutom vara, omständligt och dyrt. Problemet lindras med hjälp av en statistisk modell som utvecklats specifikt för DEEPN datauppsättningar där antalet replikat är begränsad6. För att bearbetning och analys av DNA sekvensering datamängder tillförlitlig, komplett, robust och tillgänglig utredare utan bioinformatik expertis, utvecklat vi en svit av program som täcker alla steg i analysen.
Denna svit av fristående program som körs på stationära datorer inkluderar MAPster, DEEPN och Stat_Maker. MAPster är ett grafiskt användargränssnitt som låter varje fastq fil i kö för mappning till genomet använder i HISAT2 program7, producerar en standard .sam fil för användning i efterföljande program. DEEPN har flera moduler. Det tilldelar och räkningar läser motsvarande särskild gen liknar en RNA-seq typ kvantifiering använder modulen 'Genen Count'. Också extraheras de sekvenser som motsvarar korsningen mellan Gal4 transkriptionell domänen och sekvensen bytesdjur och sammanställer placeringen av dessa korsningar att tillåta sin inspektion av jämförande tabeller och diagram (med modulen 'Junction_Make') Modulen 'Blast_Query' tillåter enkel inspektion, kvantifiering och jämförelse av korsningen Gal4 junction sekvenser. Stat_Maker utvärderar läser per gen anrikning data statistiskt som ett sätt att prioritera sannolikt Y2H träffar. Här beskriver vi hur du använder dessa program och att fullt ut analysera DNA-sekvensen data från en DEEPN Y2H experimentera. Versioner av DEEPN finns att köra på PC, Mac och Linux-system. Andra program, såsom kartläggning program MAPster och modulen DEEPN statistik Stat_Maker lita på subrutiner som körs under Unix och finns endast på Mac och linux-system.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mapster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEEPN software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statmaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum computer system</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Mac Intel Core i5 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>OS 10.10 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>Intel i5-7400 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Windows 7 or higher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Vi har anpassat jäst 2-hybrid analysen för att samtidigt avslöja dussintals övergående och statiska proteininteraktioner inom en enda skärm som utnyttjar hög genomströmning kort-Läs DNA-sekvensering. Den resulterande sekvensen datamängder kan inte bara spåra vilka gener i en population som är berikad under markeringen för positiva jäst 2-hybrid interaktioner, men också ge detaljerad information om relevanta underdomäner av proteiner tillräckligt för interaktion. Här beskriver vi en full sviten av fristående program som gör icke-experter att utföra alla bioinformatik och statistisk steg för att bearbeta och analysera DNA sekvens fastq filer från en batch jäst 2-hybrid assay. Processtegen omfattas av dessa programvara inkluderar: (1) kartläggning och räknande sekvensen läser motsvarar varje kandidat protein kodade inom ett jäst 2-hybrid prey bibliotek; (2) en statistisk analysprogram som utvärderar de berikning profilerna; och 3) verktyg för att undersöka translationell ram och ställning i regionen kodande i varje berikad plasmiden som kodar de samverkande proteinerna av intresse.

Mappning av fastq data: det första steget I praktiskt taget alla NGS program inklusive DEEPN inledande utdata är en fil av kort sekvens läser som måste mappas av anpassningen till genomisk, hänvisning transcriptomic, eller annan DNA8. Nyligen utvecklades HISAT2 justering programmet som använder algoritmer för indexering av state-of-the-art att dramatiskt öka den mappning hastighet7,9</...

Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Djupsekvensering av jäst populationer valts för positiva jäst 2-hybrid interaktioner potentiellt ger en mängd information om samverkande partner proteiner. Här, beskriver vi driften av specifika bioinformatiska verktyg och anpassade uppdaterad programvara för att analysera sekvensdata från sådana skärmar.

Datoriserad analys av sekvensdata från Batch jäst 2-Hybrid skärmar

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analys av<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing data via Tuxedo Suite på Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tvåriktad retroviral integrationsplats PCR-metodik och kvantitativ dataanalys arbetsflöde

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Romanserie upptäckten av subtraktiv genomik

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Förbättrad jäst en-hybrid skärmar att identifiera transkriptionsfaktor som binder till humant DNA sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Utforska Sekvensutrymme för att identifiera bindnings platser för regulatoriska RNA-bindande proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Poolade CRISPR-baserade genetiska skärmar i däggdjursceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...