Name: isolation, expansion, and adipogenic induction of cd34+cd31+ endothelial cells from human omental and subcutaneous adipose tissue
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00
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Los autores desean reconocer Becky Márquez, el Coordinador de la clínica en el centro de bariátrica Sentara su asistencia con el proceso de paciente investigación y consintiendo. Esta investigación fue apoyada por R15HL114062 a Anca D. Dobrian.

El Comité de revisión institucional en Eastern Virginia Medical School aprobó la investigación y recolección de muestras de tejido adiposo humano utilizado en el estudio. Se obtuvo consentimiento informado de los pacientes.
1. preparación de tampones, medios e instrumentos
<ol><li>Preparar una solución de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM cloruro sódico, cloruro de potasio 5 mM, sulfato de magnesio 1 m m, 0.4m m potasio Fosfato dibásico, 5,5 mM de glucosa, adenosina ...

<ol>
	<li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature.">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322 (5901), 583-586 (2008).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration.">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).</li><li>Min, S. 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K., Sugii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+fatty+potentials+for+therapy.">Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+two+human+preadipocyte+subtypes+with+distinct+capacities+for+replication,+adipogenesis,+and+apoptosis+varies+among+fat+depots.">Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots.</a> American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).</li><li>van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinedione-induced+lipid+droplet+formation+during+osteogenic+differentiation.">Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).</li></ol>

El enfoque de este trabajo es proporcionar una metodología para el aislamiento, expansión y adipogenic inducción de CD31 + CD34 + de las células endoteliales de los depósitos viscerales y subcutáneos de tejido adiposo humano.
Metodologías se han divulgado para el aislamiento de las células endoteliales de varios lechos vasculares de roedores o humanos que implican principalmente técnicas usando CD31 anticuerpos fluorescente etiquetado o junto a granos magnéticos18</...

La evidencia reciente muestra que tanto en ratones como en seres humanos, se puede distinguir un subconjunto de células residentes en la vasculatura de tejido adiposo en ya sea blanco o beige/brown adipocytes1,2,3. El fenotipo de estas células es un tema de controversia, con evidencias que las células endoteliales, músculo liso/pericyte o un espectro de fenotipos intermedios4,5,6,7. El alcance del desarrollo de esta metodología fue probar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células endoteliales aisladas de diferentes depósitos de grasa de los seres humanos obesos. Otros estudios en la literatura se centran en el potencial de la fracción vascular estromal total o del adipocito conocidos progenitores2,8,9adipogenic. Puesto que las tecnologías actualmente existentes pueden apuntar específicamente células endoteliales del tejido adiposo de drogas entrega10, entender el potencial de estas células a adipogenic inducción hacia adipocitos blancos o beiges es importante para futuras terapias dirigidas.
Diferentes grupos informaron la combinación de marcadores CD31 y CD34 como sustitutos para aislar las células endoteliales del tejido adiposo humano11,12,13. Por lo general, el aislamiento se realiza utilizando dos pasos secuenciales y una selección positiva mediante bolas magnéticas. En este informe, se utilizó immunoseparation usando CD34 + granos magnéticos combinados con bolas de plástico de CD31. Encontramos esta técnica superior a la immunoseparation magnético secuencial con respecto a la preservación de la morfología endoteliales típicas empedradas. También, hemos sido capaces de generar suficientes células necesarios para la expansión y adipogenic inducción a partir de tan poco como 1-2 g de grasa. Una biopsia pequeña muestra de la grasa subcutánea es suficiente para producir la cantidad necesaria de células para aplicaciones posteriores. Este aspecto es potencialmente importante, sobre todo si este método será utilizado para la detección de una respuesta a la inducción de adipogenic en sujetos humanos.
A diferencia de otros sistemas registrados en la literatura, este método utiliza sólo dos ingredientes para la inducción de adipogenic de las células de CD34 + CD31 +: un agonistas PPARy, rosiglitazona y la insulina humana. Lo importante es la cantidad de insulina utilizada cae dentro del rango de normal alta de circulante post-absorptive insulina en seres humanos14. El grado de sensibilidad a la insulina de las células en vitro, medido por el phosphorylation de Akt, no se correlaciona con su capacidad para responder a la inducción de cóctel. Curiosamente, esta inducción cóctel y experimental las condiciones de uso, una mezcla de células blancas y beige/marrón fueron obtenidos según lo determinado por el tamaño y número de gotas lipídicas intracelulares y la expresión de marcadores moleculares. Este protocolo de inducción directa y rentable junto con la evaluación cuantitativa del fenotipo de las células de la respuesta (blanca y beige) permite una proyección de agentes que potencialmente pueden alterar el equilibrio diferenciado beige : blanco adipocytes.
Este método también proporciona un enfoque traslacional para entender los mecanismos subyacentes de la adipogénesis de progenitores endoteliales vasculares en el tejido adiposo humano. Usando esta técnica de aislamiento/diferenciación específica, los investigadores pueden interrogar diversas vías responsables de Adipogénesis en un subconjunto de las células endoteliales vasculares de diferentes depósitos de grasa en los seres humanos lean y obesos.

isolation, expansion, and adipogenic induction of cd34+cd31+ endothelial cells from human omental and subcutaneous adipose tissue

La obesidad se acompaña de una amplia remodelación del tejido adiposo sobre todo a través de la hipertrofia del adipocito. Crecimiento del adipocito extremas resulta en una pobre respuesta a la insulina, la hipoxia local y la inflamación. Mediante la estimulación de la diferenciación de los adipocitos blancos funcionales de progenitores, hipertrofia radical de la población de adipocitos puede prevenirse y, en consecuencia, se puede mejorar la salud metabólica del tejido adiposo junto con una reducción de inflamación. También, estimulando una diferenciación de los adipocitos beige/marrón, el gasto de energía total del cuerpo puede aumentar, lo que resulta en pérdida de peso. Este enfoque podría prevenir el desarrollo de comorbilidades de la obesidad como diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular.
Este papel describe el aislamiento, expansión y diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de un subconjunto de las células endoteliales humanas de tejido adiposo que conjuntamente expresan los marcadores CD31 y CD34. El método es relativamente barato y no se requiere mano de obra. Requiere acceso a tejido adiposo humano y el depósito subcutáneo es adecuado para el muestreo. De este protocolo, muestras de tejido adiposo fresco de sujetos obesos mórbidos [índice de masa corporal (IMC) > 35] se recogen durante los procedimientos de cirugía bariátrica. Utilizando un immunoseparation secuencial de la fracción vascular estromal, se producen suficientes células desde tan poco como 2-3 g de grasa. Estas células pueden ampliarse en cultura durante 10 – 14 días, pueden ser criopreservadas y retienen sus propiedades adipogenic con pases hasta el paso 5 y 6. Las células se tratan durante 14 días con un coctel utilizando una combinación de la insulina humana y lo agonistas PPARy-rosiglitazona adipogenic.
Esta metodología puede utilizarse para la obtención de la prueba de los experimentos de concepto en los mecanismos moleculares que conducen a respuestas adipogenic en adiposas células endoteliales, o para la detección de nuevos fármacos que pueden mejorar la adipogenic respuesta dirigida ya sea hacia el blanco o diferenciación del adipocito marrón/beige. Utilizando pequeñas biopsias subcutáneas, esta metodología puede utilizarse para descartar temas no respondedor ensayos clínicos dirigidos a estimular los adipositos beige/marrón y blanco para el tratamiento de la obesidad y comorbilidades.

Nuestro protocolo tiene como objetivo proporcionar un enfoque en vitro para determinar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células vasculares de diferentes depósitos de tejido adiposo humano. En la figura 1Ase muestra un diagrama de diagrama de flujo simplificado. El primer paso mediante una selección positiva de CD34 expresando células resulta en > 95% CD34 + células en la población de las células recién aisladas (<strong class="xfig...

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Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

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Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

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Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

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