Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Författarna är tacksam till Meytal Radzinski för hennes bra diskussioner och kritisk läsning av artikeln och Patrick Griffin och hans lab medlemmar för deras obegränsade hjälp samtidigt fastställa HDX analys plattformen. Författarna är tacksamma att stiftelsen tyska-Israel (I-2332-1149.9/2012), den binationella Science Foundation (2015056), Marie-Curie-integration bidraget (618806), Stiftelsen Israel vetenskap (1765/13 och 2629/16), och Human Frontier Science Program (CDA00064 2014) för sitt finansiella stöd.

1. beredning av fullt reducerat och fullt oxiderat proteiner
<ol><li>
Beredning av ett fullt reducerat protein Obs: Här, vi beskriver minskningen av en zink-innehållande protein och använda en ZnCl2 lösningen att återställa Zn-införlivas, minskad protein. ZnCl2 lösningen kan bytas ut eller kasseras. Observera att tid och temperatur minskning processen beror på protein stabilitet och funktion, och är således specifikt per protein.<ol>
<li>Tina protein provet på is oc...

I detta papper föreskrivs vi protokoll analys av redox-beroende förkläde aktivitet och karakterisering av strukturella förändringar vid bindningen av ett protein som klienten. Dessa är kompletterande metoder för att definiera potentiella förkläde-substrat komplex och analysera potentiella interaktion webbplatser.
Här, tillämpat vi dessa protokoll för karakterisering av ett komplex mellan redox-reglerade förkläde Hsp33 med ett väl studerat förkläde substrat CS. Vi presenterade ...

Celler möter ofta en ansamling av reaktiva syreradikaler (ROS) produceras som biprodukter av respiration1,2, protein och lipid oxidation3,4och ytterligare processer5, 6,7. Trots ROS' positiva roll i olika biologiska processer såsom cellulär signalering8,9 och immunsvar10, uppstå en obalans mellan ROS produktion och dess avgiftning, ledande till oxidativ betona7. De biologiska målen för ROS är proteiner, lipider och nukleinsyror, oxidation av som påverkar deras struktur och funktion. Därför, ansamling av cellulära oxidanter är starkt kopplad till en rad olika sjukdomar inklusive cancer9,11, inflammation12,13och åldrande14, 15, och har befunnits vara inblandade i uppkomsten och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons och ALS sjukdom16,17,18.
Både nyligen syntetiserade och mogen proteiner är mycket känsliga för oxidation på grund av de potentiellt skadliga ändringarna av deras sida kedjor, som forma protein struktur och funktion19,20. Därför leder oxidativ stress vanligtvis till en utbredd protein inaktivering, Skellefteåsjukan och aggregering, så småningom leder till celldöd. En av de eleganta cellulära strategierna att klara av den potentiella skadan av protein oxidation är att utnyttja redox-beroende chaperones, som hämmar den utbredda protein aggregeringen, i stället för bildar stabila komplex med felveckning klienten proteiner21 ,22,23. Dessa första linjens försvar chaperones aktiveras snabbt genom en platsspecifik oxidation (vanligtvis på cystein rester) som omvandlar dem till potenta anti aggregering molekyler24. Eftersom oxidativ stress resulterar i hämning av respiration och minskningar i cellulär ATP nivåerna25, är kanoniska ATP-beroende chaperones mindre effektiva under oxidativ stress villkor25,26 ,27. Därför, redox-aktiverat ATP-oberoende chaperones spelar en viktig roll i att upprätthålla protein homeostas vid ansamling av oxidanter i bakterier och Eukaryoter (t.ex., Hsp3328 och RidA29 i bakterier, Get330 i jäst, peroxiredoxins31 i Eukaryoter). Aktiviteten av dessa följeslagare är starkt beroende av reversibel konfirmerande strukturförändringar induceras av en platsspecifik oxidation som avslöjar hydrofoba regioner involverade i erkännandet av felveckning klienten proteiner.
Forskning av mekanismen för anti aggregering och principerna för erkännande av klienten proteinerna av chaperones är inte lätt på grund av förkläde-substrat interaktioner32,33, dynamisk och heterogen 34,35,36,37. Stress-reglerade chaperones har dock en möjlighet att avancera vår förståelse av den anti aggregeringsfunktionen tack vare sin förmåga att: 1) få två olika former av förkläde, aktiv (t.ex., oxideras) och inaktiva (t.ex. sänkt), med ett införande eller borttagning av en belastning som enkelt växla mellan dem (t.ex., antioxidant och reduktionsmedel), 2) har ett brett utbud av substrat, 3) bildar mycket stabila komplex med de klient-proteiner som kan utvärderas av olika strukturella metoder, och 4) fokuserar enbart på substrat erkännande och release, medieras av redox-beroende konfirmerande förändringar, som flesta av dessa chaperones saknar den fällbara anlagen.
Här analyserar vi bakteriell redox-reglerade förkläde Hsp33's anti aggregering, en viktig del av det bakteriella försvarssystemet mot oxidation-inducerad protein aggregering28. När minskar, är Hsp33 ett tätt veckade zink-bindande protein utan förkläde aktivitet; dock när den utsätts för oxidativ stress, genomgår Hsp33 omfattande konfirmerande förändringar som exponerar dess substrat bindande regioner38,39. Vid oxidation är zink jonen som är starkt bunden till fyra mycket cystein rester av C-terminala domänen släppt40. Detta resulterar i bildandet av två disulfide obligationer, en unfoldingen av domänen C-terminal och en destabilization av de intilliggande linker region41. C-terminal och linker regionerna är mycket flexibla och definieras som inneboende eller delvis störda. Vid återkomst till icke-stress villkor, cysteines bli minskas och förkläde återgår till dess infödda vikta tillstånd utan anti aggregering aktivitet. Vika av förkläde leder till en ytterligare utspelas och destabilization av proteinet bundna klient, som utlöser dess överföring till kanoniska förkläde systemet, DnaK/J, för vika38. Analys av Hsp33's interaktion platser tyder på att Hsp33 använder båda dess laddade andningsstörningar regioner samt de hydrofoba regionerna på länkare och N-terminala domänen att fånga felveckning klienten proteiner och förhindra deras aggregering38, 42. i hopvikt skick, döljs dessa regioner av den vikta länkare och C-terminal domän. Intressant, fungerar regionen linker som en grindvakt av Hsp33's vikta och inaktiva tillstånd, ”sensing” fällbara status för dess intilliggande C-terminal domän34. När destabiliserat av mutagenes (antingen genom en punktmutation eller ett kontosystem störning), omvandlas Hsp33 till en konstitutivt aktiv förkläde oavsett redox staten i dess redox-känsliga cysteines43.
De protokoll som presenteras här tillåter övervakning av Hsp33's redox-beroende förkläde aktivitet, samt mappning konfirmerande förändringar vid aktiveringen och bindning av klienten proteiner. Denna metod kan anpassas till forskning andra förkläde-klienten erkännande modeller samt icke-förkläde protein-protein interaktioner. Dessutom presenterar vi protokoll för beredning av helt nedsatt och oxiderade chaperones som kan användas i studier av andra redox-switch proteiner, för att avslöja potentiella roller av protein oxidation på proteinaktiviteten.
Specifikt, vi beskriver en procedur för att övervaka förkläde aktivitet in vitro- och definiera dess substrat specificitet under olika typer av protein aggregation (kemiskt eller termiskt inducerad) använder ljusspridning (LS) mätt med en fluorospectrometer44. Under aggregering, ljus spridning på 360 nm ökar snabbt på grund av den ökande grumligheten. Aggregation kan således övervakas på ett tidsberoende sätt vid denna våglängd. LS är en snabb och känslig metod för att testa protein aggregering och därmed aktiviteten anti aggregering av ett protein av intresse med hjälp av nanomolar koncentrationer, aktivera karakterisering av protein aggregation-relaterade kinetiska parametrar under olika villkor. Dessutom det LS-protokollet som beskrivs här kräver inte dyra instrumentering och lätt kan fastställas i ett laboratorium.
Det är dock ganska utmanande att få ”rena” kinetic kurvor och att härleda en proteinets kinetiska parametrar från sådant ljus spridning experiment, på grund av buller och det stora antalet avvikare som genereras av luftbubblor och stora aggregat. För att övervinna detta hinder, presenterar vi ett nytt grafiskt verktyg, Kfits45, används för att minska bullernivåerna i olika kinetiska mätningar, specifikt utrustade för protein aggregering kinetiska data. Denna programvara ger preliminära kinetiska parametrar för en tidig utvärdering av resultaten och tillåter användaren att ”rena” stora mängder data snabbt utan att påverka dess kinetiska egenskaper. Kfits är genomförda i Python och finns i öppen källkod på 45.
En av de utmanande frågorna i fältet avser kartläggning interaktion platser mellan följeslagare och deras klient proteiner och förstå hur chaperones igen ett brett utbud av felveckning substrat. Denna fråga är ytterligare komplicerat när studera högdynamiska proteinkomplex som inbegriper egensäkra andningsstörningar chaperones och aggregation-benägen substrat. Lyckligtvis, strukturella masspektrometri dramatiskt har avancerat under det senaste decenniet och har framgångsrikt levererat bra metoder och verktyg för att analysera strukturell plasticitet och karta rester inblandade i protein erkännande46, 47 , 48 , 49. Här presenterar vi en sådan teknik-väte-deuterium exchange masspektrometri (HDX-MS)-som tillåter kartläggning av resthalter ändringar i en strukturell konformation vid protein modifiering eller protein/Ligand bindande35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS använder fortlöpande utbyte av ryggraden hydrogens av deuterium, som påverkas av den kemiska miljön, tillgängligheten, och kovalenta och icke-kovalent56. HDX-MS spårar dessa exchange processer med ett deutererade lösningsmedel, vanligen tungt vatten (D2O), och tillåter mätning baserat på förändringen i molekylvikt efter väte till deuterium exchange. Långsammare andelen väte-deuterium exchange kan resultera från hydrogens deltar i vätebindningar eller helt enkelt, från sterisk hinder, som visar lokala förändringar i struktur57. Förändringar vid en ligand bindning eller post-translationella modifieringar kan också leda till skillnader i väte-miljön med en bindning som resulterar i skillnader i väte-deuterium exchange (HDX) priser46,53.
Vi tillämpat denna teknik 1) karta Hsp33 regioner som snabbt utvecklas vid oxidation, vilket leder till aktivering av Hsp33, och 2) definiera potentiella bindande gränssnittet för Hsp33 med dess hellångt felveckning substrat, citrat synthase (CS)38.
De metoder som beskrivs i detta manuskript kan användas för att studera redox-beroende funktioner av proteiner i vitro, definiera anti aggregering aktivitet och rollen av strukturella förändringar (om någon) i proteinfunktion. Dessa metoder kan enkelt anpassas till olika biologiska system och tillämpas i laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

Levande organismer behöver regelbundet klara varierande miljöer under deras livscykel, inklusive ändringar i temperatur, pH, ansamling av reaktiva syreradikaler och mer. Dessa svängningar kan leda till en utbredd protein utspelas, aggregering, och celldöd. Celler har därför utvecklats en dynamisk och stress-specifika nätverk av molekylär chaperones, som upprätthåller en ”frisk” proteomet under stress villkor. ATP-oberoende chaperones utgör en stor klass av molekylär chaperones, som tjänar som första linjens försvar molekyler, skydda mot protein aggregation på ett sätt som stress-beroende. En funktion dessa chaperones har gemensamt är deras förmåga att använda strukturell plasticitet för deras stress-specifik aktivering, erkännande och versionen av felveckning klienten.
I detta papper fokuserar vi på funktionella och strukturella analysen av en sådan inneboende oordnade förkläde, den bakteriella redox-reglerade Hsp33, som skyddar proteiner mot sammanläggning under oxidativ stress. Här presenterar vi en verktygslåda med olika tekniker för att studera redox-reglerade förkläde verksamhet, liksom för mappning konfirmerande förändringar av förkläde, underliggande verksamheten. Specifikt, beskriver vi ett arbetsflöde som omfattar utarbetande av fullt reducerat och fullt oxiderat proteiner, följt av en analys av förkläde anti aggregering aktivitet in vitro- med hjälp av ljus-spridning, med fokus på graden av den anti aggregering aktivitet och dess kinetik. För att övervinna frekventa extremvärden som ackumulerats under aggregering analyser, beskriver vi användningen av Kfits, en roman grafiska verktyg som tillåter enkel bearbetning av kinetiska mätningar. Detta verktyg kan enkelt tillämpas på andra typer av kinetiska mätningar för att ta bort outliers och passande kinetiska parametrar. För att korrelera funktionen med proteinstruktur, vi beskriver setup och arbetsflödet för en strukturell masspektrometri teknik, väte-deuterium exchange-masspektrometri, som tillåter kartläggning av konfirmerande förändringar på förkläde och substratet under olika skeden av Hsp33 aktivitet. Samma metod kan tillämpas på andra protein-protein och protein-ligand interaktioner.

De två metoder som presenteras gör det möjligt att följa den kinetiska aktivitet och dynamiken av proteininteraktioner mellan ett förkläde och dess substrat. Dessutom tillåter protokollet minskning-oxidation utarbetandet av ett fullt reducerat och fullt oxiderat förkläde, ger en mer djupgående förståelse för aktivering mekanism av redox-beroende oordnade chaperones.
Vi använde först, ljusspridning för att unders?...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

En av de mest utmanande stress villkor som organismer stöta på under sin livstid innebär ansamling av oxidanter. Under oxidativ stress, celler förlita sig tungt på molekylär chaperones. Här presenterar vi metoder som används för att undersöka redox-reglerade anti aggregering aktiviteten, samt för att övervaka strukturförändringar som styr funktionen förkläde med HDX-MS.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysera dynamiska proteinkomplex monterat på och släppt från Biolayer interferometri Biosensor med hjälp av masspektrometri och elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Ett plasmaprovförberedelse för masspektrometri med hjälp av en automatiserad arbetsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...