Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
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这项工作得到了大东文化大学对 Sumino 筌的专项研究资助的财政支持。

1.线虫的同步培养
<ol><li>在播种前, 培养大肠杆菌 (大肠杆菌) 菌株 OP50 过夜在37摄氏度300毫升的 Luria-贝塔尼 (LB) 汤液培养基。将培养的 OP50 储存在-4 摄氏度。<ol>
<li>要使 LB 汤液培养基, 使用10克胰蛋白胨, 5 克酵母提取物, 10 克氯化钠和1.5 毫升 1 N 氢氧化钠, 并添加到 1 L 与去离子水。高压 釜。 注意: OP50 和C. 线虫菌株可从线虫遗传学中心 (明尼苏达大学, 圣保罗, MN, 美?...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

在使用这些色度测定试剂盒时, 样品萃取中最关键的步骤是在C. 线虫中准确检测细胞乳酸和丙酮酸是均匀化过程中的蛋白质沉淀 (图 1)。没有必要使用聚四氟乙烯均质机, 因为其他均质机 (冲击和锥形组织磨床或珠磨机) 也适合小规模的蠕虫提取。在蛋白质沉淀之前, 我们没有检测到使用匀质器提取的测试样品中的乳酸和丙酮酸。此外, 乳酸和丙酮酸水平在使用超?...

乳酸和丙酮酸浓度被广泛认为是能量代谢的中间体, 与糖酵解的状态、三羧酸酸 (TCA) 循环和有氧生物细胞中的电子传输链有关。在糖酵解氧化葡萄糖到丙酮酸的一系列反应, 它位于一个新陈代谢的十字路口, 可以通过糖异生转化为碳水化合物, 通过乙酰 CoA, 脂肪酸和能量代谢, 和氨基酸丙氨酸。TCA 循环发生在足够的溶解氧的存在下, 是葡萄糖转化为能量的基础。特别是, 二次代谢的改变是一种有趣的现象, 其中糖酵解主要用于能源生产和有氧线粒体呼吸, 涉及 TCA 循环和电子传输链, 是下调在哺乳动物癌细胞1,2。我们最近发现, 在模型有机体线虫线虫(线虫) 的衰老过程中, 乳酸水平和随之而来的乳酸/丙酮酸 (L/P) 比率下降。同样, 我们发现, 哺乳动物肿瘤抑制 p53 ortholog 相比 CEP-1 在C. 线虫通过激活其转录目标3, 在与年龄有关的能量代谢变化中发挥重要作用。
在生物检测中, 如测定细胞中的乳酸和丙酮酸浓度, 比色/荧光试剂盒的灵敏度、准确度、样本大小和孵育时间都得到了显著改善。由于技术创新, 我们现在能够分析各种代谢产物和中间代谢产物, 而不需要大规模的C. 线虫的培养, 因为它的体积小, 很难得到。一般而言, 比色法测定的灵敏度小于荧光测定的量级;然而, 比色法更适合于普通实验室的设置。此外, 含有均质性和蛋白质沉淀的萃取技术对于定量测定线虫细胞中乳酸和丙酮酸浓度是至关重要的, 因为这种线虫被封闭在外骨骼中.称为角质层, 不同于哺乳动物培养细胞系4,5。在这里, 我们描述了使用商业色度测定试剂盒分析乳酸和丙酮酸浓度的协议, 包括从线虫中抽取样品的技巧。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

乳酸和丙酮酸是细胞内能量代谢通路的关键中间体。监测细胞中的乳酸/丙酮酸比值有助于确定线粒体氧化磷酸化与有氧糖酵解之间年龄相关能量代谢是否失衡。在这里, 我们展示了用于乳酸和丙酮酸的商业色度测定试剂盒在模型有机体C. 线虫中的应用。近年来, 试剂制造商进行的研究和开发大大提高了比色/荧光试剂盒的灵敏度和准确度。改进后的试剂能够在线虫中使用96孔板的小尺度检测。一般来说, 荧光检测优于比色法的灵敏度;然而, 比色法更适合在普通实验室中使用。定量测定中的另一个重要问题是均匀化的C. 线虫样本的蛋白质沉淀。在我们的蛋白质沉淀方法中, 常用的铈沉淀剂 (三氯乙酸酸、高氯酸和偏磷酸酸) 用于样品制备。在均匀化过程中, 通过直接添加冷沉淀剂 (最终浓度为 5%) 制备无蛋白测定样品。

使用比色法测定乳酸和丙酮酸浓度的定量, 我们显示了这些检测的准确性与以前的报告中的线虫7,8。在这里, 样品萃取过程中的蛋白质沉淀是生成精确值的最关键步骤。对于蛋白质沉淀, 常见的铈沉淀剂 (e.、TCA、PCA 或偏磷酸酸) 可用于制备测试样本 (图 1)。然而, 在线虫中, 有必要在蠕虫?...

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Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

本文介绍了一种改良的小尺度萃取和比色法测定乳酸和丙酮酸在线虫中的含量.使用商用试剂盒时, 其灵敏度和准确度的技术发展非常重要。在萃取中蛋白质沉淀是定量测定细胞内代谢产物的关键步骤。

线虫线虫中乳酸和丙酮酸细胞的小尺度比色测定

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

本研究可以帮助回答生物化学计数和方法学领域的任何问题，例如线虫开发权分析。该技术的主要优点是蛋白质沉淀在外向和饮用和蠕虫的均质化。开始这个实验，在37摄氏度的37摄氏度的LB肉汤液体介质中种植大肠杆菌OP50菌株。在四摄氏度下存储成功的 OP50。移液两毫升培养OP50至少三个先前准备的NGM，或线虫生长介质阿加板，并用手旋转板传播。在室温下孵育板过夜，形成一层薄薄的OP50。接下来，使用无菌牙签从带蠕虫的盘子中挑选一块阿加，在每个 OP50 NGM 板中添加至少 100 个蠕虫。培养至少三个板与蠕虫在20摄氏度，直到蠕虫到达成人阶段，这是在立体显微镜下确认。使用立体显微镜找到装满鸡蛋的草本草。在板中加入五毫升的S缓冲液后，使用巴斯德移液器将蠕虫从所有三个板转移到15毫升锥形管中。通过加入15毫升S缓冲液，然后在室温下以300倍G离心30秒，清洗蠕虫三次。如果 S 缓冲液的体积超过 5 毫升，则离心后取出多余的缓冲液。要成功分离和散装鸡蛋分离，将蠕虫溶解在0.5毫升碱性次氯酸盐溶液中。在室温下倒置和孵育10至15分钟。以 1，400 RPM 的速度离心 30 秒，以去除溶液。使用15毫升S缓冲液清洗鸡蛋颗粒。离心后，它取出上经剂，并重复此洗涤至少三次。上次洗涤后，我们悬浮在五至六毫升的S缓冲液中，不带大肠杆菌，在20摄氏度下孵育卵子，孵化卵子，实现L1级幼虫的H同步培养。在三个盖滑单上移液 10 微升含有 L1 蠕虫的 S 缓冲器。在立体显微镜下计算幼虫数值，并计算平均值以确定 L1 级幼虫的近似数量。最后，将L1阶段幼虫转移到5个NGM Agar板与OP50，并在20摄氏度生长，直到年轻的成人阶段，在此期间进行自我受精和几个卵子的产卵。每天在显微镜下观察蠕虫，然后收集年轻的成年人，或五天大的蠕虫。要仅选择活蠕虫，请将悬浮在三到四毫升 S 缓冲液中的蠕虫添加到 15 毫升锥形管中。然后加入同等体积的冰冷60%蔗糖和混合。在4摄氏度下将管在1500倍G下离心15秒，15秒。然后使用巴斯德移液器小心地将蠕虫从管壁上移出，然后将漂浮的蠕虫取出到新鲜管中。用 S 缓冲液填充管中清洗蠕虫，并在 4 摄氏度下以 1500 次 G 离心 30 秒。拆下缓冲液并再重复洗涤两次。第三次洗涤后，小心地取出上流液，确保不清除任何蠕虫，并使用1000微升移液器尖端测量洗涤蠕虫的湿体积。对于蛋白质沉淀，使用巴斯德移液器将洗涤的蠕虫添加到放在冰上的均质剂中等量的冰冷 10% 三氯乙酸中。使用旋转的 40 冲程进行均质化，转速高达 1，300 RPM。使用具有 20% 占空比的超声波均质器对均质进行声波化。使用巴斯德移液器将均质转移到放在冰上的1.5毫升管。将均质转移到微型离心管后，在4摄氏度的G下用8000次G离心，10分钟进行澄清。将上一液转移到一个新鲜的管子中，加入四个氯化钾，在冰上孵育20分钟，将其中和。然后在4摄氏度下将G的8000倍离心10分钟。将上一液转移到新鲜管中，并在 80 摄氏度下储存，直到需要进一步检测。要测量乳酸的浓度，请使用色度测定试剂盒对测试样品进行重复分析。将测试样品的10微升添加到96井板的每个井中，然后向每个样品添加乳酸检测缓冲液，将体积调整为15微升。将100毫摩尔L+乳酸标准与乳酸测定缓冲液稀释至1毫摩尔。然后，放入一系列井中，加入零、二、四、六、八和十微升稀释的 L+乳酸盐标准。在每个井中加入50微升的反应混合物，并在室温下孵育，防止光线至少30分钟，使颜色形成。最后，使用微孔板读取器测量每孔在 570 纳米的吸光度。从反应混合物的吸收度中减去背景控制混合物的吸光度。然后绘制乳酸标准曲线，通过将每个浓度乘以 2.25 来计算曲线中的乳酸浓度。使用色度测定试剂盒测量测试样品中丙酮酸盐的浓度，并进行双工检查。将测试样品的10微升添加到96孔板的不同孔中，并在每个样品中加入90微升的工作试剂。在室温下孵育30分钟。然后将板放在微孔板读卡器中，以测量每孔在 570 纳米处的吸水性。绘制丙酮酸盐标准曲线，通过将每个浓度乘以 2.25 来计算标准曲线中的丙酮酸盐浓度。最后，要测量测试样品中的蛋白质浓度，请使用文本协议中描述的色度测定试剂盒。蛋白质沉淀后，色度测定可用于乳酸和丙酮酸盐浓度的定量测定。这个实验显示了与C.Elegans之前的报告相反的色度测定的准确性。此外，这些测定足够敏感，即使在小规模样品中，也足以在短时间内测量乳酸和丙酮酸盐浓度。为了准确检测C.elegans中的乳酸和丙酮酸盐，在蠕虫均质过程中进行蛋白质沉淀至关重要。当样品在均质过程中沉淀蛋白质时，与完整的细胞酸分相比，或在完全未检测到乳酸或丙酮酸盐时，在均质化后，检测到的乳酸和丙酮酸盐的含量更高。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

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科研

生物化学

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核糖体组蛋白的体外泛化和二次基质测定

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