Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dette arbejde blev økonomisk støttet af en særlig forskning tilskud fra Daito Bunka Universitet til Sumino Yanase.

1. synkroniseret kultur af C. elegans
<ol><li>Før såning, kultur Escherichia coli (E. coli) stamme OP50 natten over ved 37 ° C i 300 mL Luria-Bertani (LB) bouillon flydende medium. Gemme den kulturperler OP50 på-4 ° C.<ol>
<li>For at gøre LB bouillon flydende medium, bruge 10 g trypton, 5 g gær extract, 10 g NaCl og 1,5 mL 1 N NaOH, og tilføje til 1 L med deioniseret vand. Autoklave. Bemærk: OP50 og C. elegans stammer er tilgængelige fra Caenorhabditis genetik Center (Un...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

Når man bruger disse kolorimetriske assay kits, er den mest afgørende skridt i stikprøven udvinding til at opdage cellulære laktat og pyruvat præcist i C. elegans processen med protein nedbør i løbet af homogenisering (figur 1). Det er ikke strengt nødvendigt at bruge en Teflon homogeniseringsapparat, som andre homogenizers (fx., Dounce, og tilspidset væv vinkelslibere eller perle mills) er også velegnet til små udvinding af orme. Vi gjorde ikke opdager cellulær...

Laktat og pyruvat koncentrationer er bredt anerkendt som mellemprodukter af energimetabolisme, og er relateret til stater af glykolyse, tricarboxylic syre (TCA) cyklus og elektron transportkæde i cellerne i aerobe organismer. En serie af reaktionerne i glykolysen oxidere glukose til pyruvat, der ligger ved en metabolisk korsvej og kan konverteres til kulhydrater gennem glukoneogenese, fedtsyrer og energimetabolisme gennem acetyl-CoA og aminosyre alanin. TCA cyklus opstår under tilstedeværelsen af tilstrækkelig opløst ilt og er grundlæggende for konvertering af glukose til energi. Især, ændring af sekundære metabolisme er et interessant fænomen som glykolyse bruges overvejende til energiproduktion og aerob mitokondrie respiration, som omfatter TCA cyklus og elektron transportkæde, er downregulated i pattedyr kræft celler1,2. Vi viste for nylig at laktat niveauer og det deraf følgende laktat/pyruvat (L/P) forholdet faldt under aldring i model organisme Caenorhabditis elegans (C. elegans). Vi fandt ligeledes, at pattedyr tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en vigtig rolle i de aldersrelaterede ændringer af energimetabolisme gennem aktivering af sin transcriptional mål3.
I biologiske assays, såsom måling af laktat og pyruvat koncentrationer i celler, har følsomhed, nøjagtighed, samplingstørrelse og inkubationstiden for kolorimetriske/fluorimetri assay kits forbedret dramatisk. På grund af teknologiske innovationer er vi nu i stand til at analysere forskellige metabolitter og mellemliggende metabolitter uden den store kultur af C. elegans, som er vanskeligt givet sin lille størrelse. Følsomheden af en kolorimetrisk assay er generelt en størrelsesorden mindre end for en fluorimetri assay; den kolorimetriske metode er dog mere egnet i fastsættelsen af fælles laboratorier. Derudover er en udvinding teknik indeholdende homogenisering og protein nedbør afgørende for kvantitativ bestemmelse af laktat og pyruvat koncentrationer i C. elegans celler, fordi denne nematode er omsluttet af en exoskeleton kaldet neglebånd, i modsætning til pattedyr kulturperler celle linjer4,5. Her, beskriver vi en protokol for at analysere laktat og pyruvat koncentrationer ved hjælp af kommercielle kolorimetriske assay kits herunder tips til prøven udvinding fra C. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Laktat og pyruvat er centrale mellemprodukter af intracellulære energi stofskifteveje. Overvågning laktat/pyruvat forholdet i celler hjælper med at afgøre, om der er en ubalance i aldersrelaterede energimetabolisme mellem mitokondriel oxidativ fosforylering og aerob glykolyse. Her, viser vi udnyttelsen af kommercielle kolorimetriske assay kits til laktat og pyruvat i model organisme C. elegans. For nylig, følsomhed og nøjagtighed af de kolorimetriske/fluorimetri assay kits er blevet forbedret betydeligt de forsknings-og udført af reagens producenter. De forbedrede reagenser har aktiveret brug af små assays med 96 brønde plade i C. elegans. Generelt er en fluorimetri assay overlegen i følsomhed til en kolorimetrisk assay; men den kolorimetriske metode er mere velegnet til brug i almindelige laboratorier. Et andet vigtigt emne i disse assays til kvantitativ bestemmelse er protein udfældning af homogeniseret C. elegans prøver. I vores protein nedbør metode, fælles precipitants (fx., trichloreddikesyre, perchlorsyre og metaphosphoric syre) bruges til forberedelse af prøver. Et protein-fri assay prøven er udarbejdet af direkte tilføje kolde fældningsmiddel (endelig koncentration på 5%) i løbet af homogenisering.

Bruger de kolorimetriske assays til kvantitativ bestemmelse af laktat og pyruvat koncentrationer, viste vi nøjagtigheden af disse assays sammenlignet med tidligere betænkninger i C. elegans7,8. Her var processen med protein nedbør under prøven udvinding det mest afgørende skridt til at generere nøjagtige værdier. Protein fældningen, fælles precipitants (fx., TCA, PCA, eller metaphosphoric syre) kan bruge...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Vi beskriver en modificeret små udvinding og kolorimetriske assays af laktat og pyruvat i fyrretræsnematoden C. elegans. Når udnytte kommerciel assay kits, er den tekniske udvikling af deres følsomhed og nøjagtighed vigtige. Protein nedbør i udvinding er det mest afgørende skridt for kvantitativ bestemmelse af intracellulære metabolitter.

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Denne forskning kan hjælpe med at besvare eventuelle spørgsmål i dem biokemige tælle og metode område såsom en analyse af udviklingsrettigheder i nematode. Den største fordel ved denne teknik er protein nedbør i ekstraduktion og drikke og homogenisering af ormene. Start dette eksperiment ved at dyrke E.coli OP50 stamme i 300 milliliter LB bouillon flydende medium ved 37 grader Celsius natten over.Opbevar succeset OP50 ved fire grader Celsius. Pipette to milliliter af den dyrkede OP50 på mindst tre tidligere forberedte NGM, eller Nematode Vækst Media Agar Plader og spredes i hånden hvirvlende pladen. Inkuber pladerne ved stuetemperatur natten over for at skabe et tyndt lag OP50.Brug derefter en steril tandstikker til at vælge et stykke agar fra en plade med orme for at tilføje mindst 100 orme til hver OP50 NGM plade. Kultur mindst tre plader med orme ved 20 grader Celsius, indtil ormene nå voksne fase, som er bekræftet under stereoskopisk mikroskop. Find gravid hermafroditter fyldt med æg ved hjælp af et stereoskopisk mikroskop.Efter at have tilføjet fem milliliter S-buffer til plader, skal du bruge Pasteur pipette til at overføre ormene fra alle tre plader til et 15 milliliter konisk rør. Bemuderne vaskes tre gange ved at tilsætte 15 milliliter S-buffer og derefter centrifugere ved 300 gange G ved stuetemperatur i 30 sekunder. Hvis mængden af S-buffer overstiger fem milliliter, fjernes den overskydende buffer efter centrifugering.For vellykket eksonisering og bulk æg isolering, opløse ormene i 0,5 milliliter alkalisk hypochlorat opløsning. Bland ved invertering og inkubering ved stuetemperatur i 10 til 15 minutter. Centrifuge ved 1,400 omdr./min. i 30 sekunder for at fjerne opløsningen.Brug 15 milliliter S-buffer til at vaske ægpellet. Efter centrifugering fjernes supernatanten, og denne vask gentages mindst tre gange. Efter den sidste vask, suspenderer vi pellet i fem til seks milliliter S-buffer, uden E.coli og inkubere æggene natten over ved 20 grader Celsius at klække dem og opnå H synkron kultur L1 fase larver.Pipette 10 mikroliter af S-buffer, der indeholder L1 orme på tre dækslidder. Grev larverne under et stereoskopisk mikroskop, og udregn gennemsnittet for at bestemme det omtrentlige antal L1-trinslarver. Endelig overføre L1 fase larver til fem NGM Agar Plader med OP50 og dyrke dem ved 20 grader Celsius indtil den unge voksne fase, hvor selvbefrugtning opstår, og et par æg er lagt.Overhold ormene hver dag under mikroskopet og derefter indsamle den unge voksne, eller fem dage gamle orme. Hvis du kun vil vælge levende orme, skal du tilføje ormene, der er suspenderet i tre til fire milliliter S-buffer, til et konisk rør på 15 milliliter. Derefter tilsættes en lige mængde iskold 60% saccharose og bland.Centrifuge røret ved 1, 500 gange G ved fire grader Celsius i 15 sekunder. Brug derefter en Pasteur pipette til forsigtigt at flytte ormene væk fra rørets væg, og fjern derefter de flydende orme i et frisk rør. Fyld røret med S-buffer til at vaske orme, og centrifuge ved 1500 gange G ved fire grader Celsius i 30 sekunder.Fjern bufferen, og gentag vasken to gange mere. Efter den tredje vask, forsigtigt fjerne supernatant, og sørg for ikke at fjerne nogen orme, og bruge en 1, 000 mikroliter pipette spids til at måle den våde volumen af de vaskede orme. For protein nedbør, bruge en Pasteur pipette til at tilføje de vaskede orme til en lige stor mængde iskold 10% trichloreddikesyre i en homogenis placeret på is.Homogeniser ved hjælp af 40 slag passel med rotation, op til 1, 300 RPM. Brug en ultralydshomogenisator med 20% arbejdscyklus til at sonikere homogenatet. Brug en Pasteur pipette til at overføre homogenatet til 1,5 milliliterrør placeret på is.Efter overførsel af homogenatet til et mikrocentrifugerør, centrifuge ved 8,000 gang G ved fire grader Celsius i 10 minutter for at afklare det. Overfør supernatanten til et frisk rør og tilsæt fire molar kaliumchlorid og inkuber på is i 20 minutter for at neutralisere det. Derefter centrifuge det på 8, 000 gange G ved fire grader Celsius i 10 minutter.Overfør supernatanten til et frisk rør og opbevar ved 80 grader Celsius, indtil det er nødvendigt for yderligere analyser. Til måling af koncentrationen af laktat anvendes et koloimetrisk analysesæt til at udføre dobbeltanalyser for testprøverne. Der tilsættes 10 mikroliter af testprøverne til hver brønd på en 96-brøndplade, og der tilsættes derefter laktatassayffer til hver prøve for at justere volumen til 15 mikroliter.100 millimolar L+Lactate Standard fortyndes med laktatassaffer til en millimolar. Derefter, i en række brønde, tilføje nul, to, fire, seks, otte og 10 mikroliter af fortyndet L + Lactate Standard. Tilføj 50 mikroliter reaktion mix til hver brønd, og inkubere ved stuetemperatur beskyttet mod lys i mindst 30 minutter for farven at udvikle.Endelig skal du bruge en mikropladelæser til at måle absorbansen af hver brønd ved 570 nanometer. Træk absorbansen af baggrundskontrolblandingen fra reaktionsblandingens absorbans. Laktatstandardkurven afbildes derefter, og laktatkoncentrationerne beregnes fra kurven ved at gange hver koncentration med 2,25.Brug et koloimetrisk analysesæt til at måle koncentrationen af pyruvat i testprøverne og udføre dupleksundersøgelser. Der tilsættes 10 mikroliter af testprøverne til forskellige brønde på en 96-brøndplade, og der tilsættes 90 mikroliter arbejdsreageagent til hver prøve. Inkuber dækket i 30 minutter ved stuetemperatur.Anstænker derefter pladen i mikropladelæseren for at måle sugendeheden af hver brønd ved 570 nanometer. Pyruvatstandardkurven afbildes, og pyruvatkoncentrationerne beregnes fra standardkurven ved at gange hver koncentration med 2,25. Og endelig, at måle proteinkoncentrationen i testprøverne, bruge en koloimetrisk analyse kit som beskrevet i tekstprotokollen.Efter proteinudfældning kan koloimetriske analyser anvendes til kvantitativ bestemmelse af laktat- og pyruvatkoncentrationer. Dette eksperiment viser nøjagtigheden af koloimetriske analyser i modsætning til tidligere rapporter i C.Elegans. Desuden er disse analyser tilstrækkeligt følsomme til at måle laktat- og pyruvatkoncentrationerne selv i små prøver på kort tid.For præcist at detektere laktat og pyruvat i C.elegans, er det afgørende at udføre proteinfældning under homogenisering af ormene. Den påviste mængde laktat og pyruvat er højere, når prøverne udfældes under homogeniseringen sammenlignet med intakt cyklisk fraktion eller efter homogenisering, når der slet ikke blev påvist laktat eller pyruvat.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Kovalent binding af antistoffer til cellulosepapir diske og deres anvendelser i Naked-eye Farvemåletekniske Immunoassays

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kortlægning stofskifte: Overvågning af laktat Dehydrogenase aktiviteten direkte i væv

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestemmelse af Phycobiliprotein indhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plade-baserede storstilet dyrkning af Caenorhabditis elegans: forberedelse af prøver til undersøgelse af stofskifteforandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...