Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dit werk werd financieel ondersteund door een speciale subsidie van het onderzoek van de Daito Bunka universiteit naar Sumino Yanase.

1. gesynchroniseerde cultuur van C. elegans
<ol><li>Vóór het zaaien stam cultuur de Escherichia coli (E. coli) OP50 's nachts bij 37 ° C in 300 mL Luria Bertani (LB) Bouillon vloeibare voedingsbodem. Winkel de gekweekte OP50 bij-4 ° C.<ol>
<li>Maken van LB Bouillon opgietvloeistof, 10 g trypton, gistextract 5 g, 10 g NaCl en 1,5 mL 1 N NaOH gebruiken, en toevoegen aan 1 L met gedeïoniseerd water. Autoclaaf. Opmerking: OP50 en C. elegans stammen zijn beschikbaar vanaf de Caeno...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

Bij gebruik van deze colorimetrische bepaling kits, is de meest kritische stap in monster extractie te detecteren van cellulaire lactaat en pyruvaat nauwkeurig in C. elegans het proces van eiwit neerslag tijdens homogenisering (Figuur 1). Het is niet strikt noodzakelijk is om het gebruik van een Teflon-homogenizer, als andere homogeniseerders (bijv., Dounce en tapered weefsel slijpmachines, of kraal molens) zijn ook geschikt voor de kleinschalige winning van wormen. We did ...

Lactaat en pyruvaat concentraties worden algemeen beschouwd als tussenproducten van de energie-stofwisseling en zijn gerelateerd aan de Staten van de glycolyse, tricarboxylic acid (TCA) cyclus en elektronentransport keten in de cellen van aerobe organismen. Een reeks reacties in de glycolyse oxideren glucose om pyruvaat, die ligt op een kruispunt van metabole en kan worden geconverteerd naar koolhydraten via gluconeogenese, vetzuren en energiemetabolisme door acetyl-CoA en het aminozuur alanine. De TCA cyclus gebeurt onder de aanwezigheid van voldoende opgeloste zuurstof en is essentieel voor de omzetting van glucose naar energie. Vooral de wijziging van de secundaire metabolisme is een interessant fenomeen waarin glycolyse voornamelijk voor de energieproductie gebruikt wordt en aërobe mitochondriale ademhaling, waarbij de TCA cyclus en het elektronentransport keten, werden in zoogdieren kanker cellen1,2. We toonden onlangs dat de niveaus van lactaat en de daaruit voortvloeiende lactaat/pyruvaat (L/P)-ratio tijdens veroudering in de model-organisme Caenorhabditis elegans (C. elegans daalde). We vonden ook dat de zoogdieren tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 in C. elegans een belangrijke rol in de leeftijd-gerelateerde veranderingen van energiemetabolisme door de activering van de transcriptionele doelstellingen3 heeft.
In biologische testen, zoals het meten van lactaat en pyruvaat concentraties in cellen, zijn de gevoeligheid, de nauwkeurigheid, de steekproefgrootte, en de incubatietijd van colorimetrische/fluorimetrische assay kits verbeterd drastisch. Als gevolg van technologische innovaties zijn we nu in staat om te analyseren verschillende metabolieten en intermediaire metabolieten zonder de grootschalige cultuur van C. elegans, dat is moeilijk gezien de kleine omvang. In het algemeen, is de gevoeligheid van een colorimetrische bepaling een orde van grootte kleiner dan die van een fluorimetrische assay; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt in de instelling van gemeenschappelijke laboratoria. Bovendien, een techniek van de extractie met homogenisering en eiwit neerslag is van cruciaal belang voor de kwantitatieve bepaling van de concentratie van lactaat en pyruvaat in C. elegans cellen omdat deze nematode is ingesloten in een exoskelet genaamd de cuticle, in tegenstelling tot zoogdieren gekweekte cel lijnen4,5. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van lactaat en pyruvaat concentraties werken met commerciële colorimetrische bepaling kits inclusief tips voor monster extractie van C. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Lactaat en pyruvaat zijn belangrijke tussenproducten van intracellulaire energie metabolische routes. Toezicht op de lactaat/pyruvaat ratio in cellen helpt om te bepalen of er een onbalans in de leeftijdsgebonden energiemetabolisme tussen Mitochondriale oxidatieve fosforylatie en aërobe glycolyse. Hier, laten we het gebruik van commerciële colorimetrische bepaling kits voor lactaat en pyruvaat in de model-organisme C. elegans. Onlangs, de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de colorimetrische/fluorimetrische assay kits zijn verbeterd sterk door onderzoek en ontwikkeling olv reagens fabrikanten. De verbeterde reagentia hebt ingeschakeld op het gebruik van kleinschalige tests met een 96-wells-plaat in C. elegans. In het algemeen, is een fluorimetrische assay superieur in gevoeligheid aan een colorimetrische bepaling; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt voor het gebruik in gemeenschappelijke laboratoria. Een ander belangrijk punt in deze tests voor kwantitatieve bepaling is eiwit precipitatie van gehomogeniseerde C. elegans monsters. In onze eiwit neerslag methode, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., trichloorazijnzuur, perchloorzuur en metaphosphoric zuur) worden gebruikt voor de bereiding van de monsters. Een eiwit-gratis test sample wordt bereid door koude neerslaande (eindconcentratie van 5%) tijdens de homogenisering direct toe te voegen.

Met behulp van de colorimetrische testen voor de kwantitatieve bepaling van de concentraties lactaat en pyruvaat, toonden we de juistheid van deze tests vergeleken met vorige verslagen in C. elegans7,8. Hier, was het proces van eiwit neerslag tijdens de extractie van het monster de meest cruciale stap voor het genereren van nauwkeurige waarden. Bij eiwit precipitatie, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., TCA...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dit onderzoek kan helpen bij het beantwoorden van vragen in hen biochem tellen en methodologie veld, zoals een analyse van de ontwikkelingsrechten in aaltjes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is eiwitneerslag in extraductie en drank en homogenisatie van de wormen. Start dit experiment door het kweken van E.coli OP50 stam in 300 milliliter LB bouillon vloeibaar medium op 37 graden Celsius 's nachts.Bewaar succesvolle OP50 op vier graden Celsius. Pipette twee milliliters van de gekweekte OP50 op minimaal drie eerder voorbereide NGM, of Nematode Growth Media Agar Platen en verspreid met de hand wervelende de plaat. Incubeer de platen bij kamertemperatuur 's nachts om een dunne laag OP50 te creëren.Gebruik vervolgens een steriele tandenstoker om een stuk agar uit een plaat met wormen te halen, om minstens 100 wormen toe te voegen aan elke OP50 NGM-plaat. Kweek ten minste drie platen met de wormen bij 20 graden Celsius, totdat de wormen het volwassen stadium bereiken, wat wordt bevestigd onder stereoscopische microscoop. Zoek gravid hermafrodieten gevuld met eieren met behulp van een stereoscopische microscoop.Na het toevoegen van vijf milliliter S-buffer aan platen, gebruik Pasteur pipet om de wormen van alle drie de platen over te brengen naar een 15 milliliter conische buis. Was de wormen drie keer door het toevoegen van 15 milliliter S-buffer en vervolgens centrifugeren op 300 keer G bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Als het volume van de S-buffer meer dan vijf milliliter bedraagt, verwijdert u de overtollige buffer na het centrifugeren.Voor succesvolle exonisatie en bulk ei isolatie, los de wormen in 0,5 milliliter alkalische hypo chloraat oplossing. Meng door te keren en incubeer op kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Centrifuge op 1, 400 RPM gedurende 30 seconden om de oplossing te verwijderen.Gebruik 15 milliliter S-buffer om de eierkorrel te wassen. Na het centrifugeren verwijdert het de supernatant en herhaal deze was minstens drie keer. Na de laatste wasbeurt schorten we de pellet op in vijf tot zes milliliter S-buffer, zonder E.coli en broeden we de eieren 's nachts uit bij 20 graden Celsius om ze uit te broeden en H synchrone kweek van L1-traplarven te bereiken.Pipette 10 microliters van S-buffer met L1 wormen op drie dektappen. Tel de larven onder een stereoscopische microscoop en bereken het gemiddelde om het geschatte aantal L1-trapslarven te bepalen. Breng ten slotte de L1-faselarven over op vijf NGM Agar-platen met OP50 en laat ze groeien bij 20 graden Celsius tot het stadium van de jonge volwassene, waarin zelfbevruchting plaatsvindt en een paar eieren worden gelegd.Observeer de wormen elke dag onder de microscoop en verzamel vervolgens de jonge volwassene, of vijf dagen oude wormen. Om alleen levende wormen te selecteren, voeg de wormen opgehangen in drie tot vier milliliter S-buffer aan een 15 milliliter conische buis. Voeg vervolgens een gelijk volume van ijskoude 60% sacharose toe en meng.Centrifuge de buis op 1, 500 keer G bij vier graden Celsius gedurende 15 seconden. Gebruik vervolgens een Pasteur pipet om de wormen voorzichtig van de muur van de buis te bewegen en verwijder vervolgens de drijvende wormen in een verse buis. Vul de buis met S-buffer om de wormen te wassen, en centrifuge op 1500 keer G bij vier graden Celsius gedurende 30 seconden.Verwijder de buffer en herhaal de was nog twee keer. Verwijder na de derde wasbeurt voorzichtig de supernatant, zorg ervoor dat u geen wormen verwijdert en gebruik een 1.000 microliter pipetpunt om het natte volume van de gewassen wormen te meten. Voor eiwitneerslag gebruikt u een Pasteurpipet om de gewassen wormen toe te voegen aan een gelijk volume ijskoud 10%trichloorazijnzuur in een homogenisator die op ijs wordt geplaatst.Homogeniseren met behulp van 40 slagen van passel met rotatie, tot 1,300 RPM. Gebruik een ultrasone homogenisator met 20% duty cyclus om het homogenaat sonicate. Gebruik een Pasteur pipet om het homogenaat over te brengen naar 1,5 milliliter buis geplaatst op ijs.Na het overbrengen van het homogenaat naar een microcentrifugebuis, centrifuge op 8,000 tijd G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het te verduidelijken. Breng de supernatant naar een verse buis en voeg vier molaire kaliumchloride en incubeer op ijs gedurende 20 minuten om het te neutraliseren. Dan centrifugeren op 8,000 keer G op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Breng de supernatant naar een verse buis en bewaar op 80 graden Celsius tot het nodig is voor verdere tests. Gebruik een colorimetrische testkit om dubbele analyses uit te voeren voor de testmonsters om de concentratie van lactaat te meten. Voeg 10 microliter van de testmonsters toe aan elke put van een 96-putplaat en voeg vervolgens lactaattestbuffer toe aan elk monster om het volume aan te passen aan 15 microliter.Verdun 100 millimolar L+Lactaat Standaard met lactaattestbuffer tot één millimolar. Voeg vervolgens in een reeks putten nul, twee, vier, zes, acht en tien microliter van verdunde L+Lactaat-standaard toe. Voeg 50 microliter van reactie mix aan elke put, en uitbroeden bij kamertemperatuur beschermd tegen licht gedurende ten minste 30 minuten voor de kleur te ontwikkelen.Ten slotte, gebruik maken van een microplate lezer om de absorptie van elke put te meten op 570 nanometer. Trek de absorptie van de achtergrondcontrolemix af van de absorptie van het reactiemengsel. Zet vervolgens de standaardcurve van het lactaat in kaart en bereken de lactaatconcentraties uit de curve door elke concentratie met 2,25 te vermenigvuldigen.Gebruik een colorimetrische testkit om de concentratie pyruvaat in de testmonsters te meten en duplexonderzoeken uit te voeren. Voeg 10 microliter van de testmonsters toe aan verschillende putten van een 96-putplaat en voeg 90 microliter werkende reagens toe aan elk monster. Incubeer 30 minuten bedekt bij kamertemperatuur.Plaats vervolgens de plaat in de microplatelezer om de absorptie van elke put op 570 nanometer te meten. Zet de standaardcurve van pyruvaat in kaart en bereken de pyruvaatconcentraties uit de standaardcurve door elke concentratie met 2,25 te vermenigvuldigen. En ten slotte, om de eiwitconcentratie in de testmonsters te meten, gebruik een colorimetrische testkit zoals beschreven in het tekstprotocol.Na eiwitneerslag kunnen colorimetrische tests worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van lactaat- en pyruvaatconcentraties. Dit experiment toont de nauwkeurigheid van colorimetrische tests in tegenstelling tot eerdere rapporten in C.Elegans. Bovendien zijn deze tests voldoende gevoelig voor het meten van lactaat- en pyruvaatconcentraties, zelfs in kleinschalige monsters in korte tijd.Om lactaat en pyruvaat in C.elegans nauwkeurig te detecteren, is het cruciaal om eiwitneerslag uit te voeren tijdens homogenisatie van de wormen. De hoeveelheid lactaat en pyruvaat gedetecteerd is hoger wanneer monsters eiwit neergeslagen tijdens homogenisatie, in vergelijking met intacte cytosolische fractie of na homogenisatie wanneer er geen lactaat of pyruvaat gedetecteerd op alle.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...