Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione speciale di ricerca da Daito Bunka University a Sumino Yanase.

1. sincronizzata cultura di c. elegans
<ol><li>Prima della semina, cultura dell' Escherichia coli (Escherichia coli) ceppo OP50 durante la notte a 37 ° C in 300 mL di terreno liquido di brodo di Luria-Bertani (LB). Conservare il OP50 coltivate-4 ° C.<ol>
<li>Per rendere il mezzo liquido di brodo LB, utilizzare 10 g di triptone, 5 g di Estratto di lievito, 10 g di NaCl e 1,5 mL di NaOH N 1 e aggiungere a 1 L con acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave. Nota: Ceppi OP50 e c. elega...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

Quando si utilizzano questi kit di analisi colorimetrica, la fase più critica nell'estrazione del campione per rilevare cellulare del lattato e del piruvato con precisione in c. elegans è il processo di precipitazione della proteina durante l'omogeneizzazione (Figura 1). Non è strettamente necessario utilizzare un omogeneizzatore di Teflon, come altri omogeneizzatori (ad es., lisata e conico smerigliatrici del tessuto, o mulini del branello) sono adatti anche per l'estra...

Le concentrazioni di lattato e piruvato sono ampiamente considerate come prodotti intermedi del metabolismo energetico e sono correlate agli Stati di glicolisi, ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e catena di trasporto degli elettroni nelle cellule degli organismi aerobici. Una serie di reazioni nella glicolisi ossidare il glucosio a piruvato, che si trova a un bivio metabolico e può essere convertito per carboidrati attraverso gluconeogenesi, acidi grassi e metabolismo energetico attraverso acetil-CoA e l'aminoacido alanina. Ciclo del TCA si verifica in presenza di sufficiente ossigeno disciolto ed è fondamentale per la conversione del glucosio in energia. Soprattutto, l'alterazione del metabolismo secondario è un fenomeno interessante in cui la glicolisi è usata principalmente per la produzione di energia e la respirazione mitocondriale aerobica, che coinvolge il ciclo del TCA e la catena di trasporto degli elettroni, è downregulated in mammiferi cancro cellule1,2. Abbiamo mostrato recentemente che i livelli di lattato e il rapporto lattato/piruvato conseguente (L/P) è diminuito durante l'invecchiamento dell'organismo modello Caenorhabditis elegans (c. elegans). Allo stesso modo, abbiamo trovato che il mammifero tumore soppressore p53 ortholog CEP-1 c. elegans ha un ruolo importante nelle alterazioni del metabolismo energetico attraverso l'attivazione dei suoi bersagli trascrizionali3età-correlate.
In saggi biologici, come la misurazione delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule, sono stati migliorati drammaticamente la sensibilità, precisione, dimensione del campione e tempo di incubazione di kit di saggio colorimetrico/fluorimetrico. A causa di innovazioni tecnologiche, siamo ora in grado di analizzare vari metaboliti e metaboliti intermedi senza la cultura su larga scala di c. elegans, che è difficile date le sue piccole dimensioni. In generale, la sensibilità di un saggio colorimetrico è un ordine di grandezza più piccolo di quello di un'analisi fluorimetrica; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto nella cornice di laboratori comuni. Inoltre, una tecnica di estrazione contenente la precipitazione della proteina e di omogeneizzazione è cruciale per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule di c. elegans , perché questo nematode è racchiuso in un esoscheletro chiamato la cuticola, a differenza di linee cellulari di mammifero coltivate4,5. Qui, descriviamo un protocollo per analizzare le concentrazioni di lattato e piruvato usando i kit di analisi colorimetrica commerciali compresi suggerimenti per l'estrazione del campione da c. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Lattato e piruvato sono intermedi chiave delle vie metaboliche di energia intracellulare. Monitoraggio del rapporto lattato/piruvato in cellule aiuta a determinare se vi è uno squilibrio nel metabolismo energetico senile tra fosforilazione ossidativa mitocondriale e glicolisi aerobica. Qui, ci mostra l'utilizzo di kit di analisi colorimetrica commerciale per lattato e piruvato nell'organismo modello di c. elegans. Recentemente, la sensibilità e la precisione dei kit colorimetrico/fluorimetrica dosaggio sono stati migliorati notevolmente dalla ricerca e sviluppo condotti da produttore di reagente. I reagenti migliorati hanno permesso l'uso di dosaggi in piccola scala con una piastra a 96 pozzetti in c. elegans. In generale, un'analisi fluorimetrica è superiore nella sensibilità a un saggio colorimetrico; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto per l'uso nei comuni laboratori. Un'altra questione importante in queste analisi per la determinazione quantitativa è precipitazione della proteina di omogeneizzato di c. elegans campioni. Nel nostro metodo di precipitazione della proteina, precipitanti comune (ad es., acido tricloroacetico, acido perclorico e acido metafosforico) vengono utilizzati per la preparazione del campione. Un campione di analisi senza proteine è preparato aggiungendo direttamente freddo precipitante (concentrazione finale del 5%) durante l'omogeneizzazione.

Utilizzando l'analisi colorimetriche per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato, abbiamo mostrato la precisione di questi saggi rispetto ai rapporti precedenti in c. elegans7,8. Qui, il processo di precipitazione della proteina durante l'estrazione del campione è stato il passaggio più importante per generare valori accurati. Per precipitazione della proteina, precipitanti comune (...

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Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Questa ricerca può aiutare a rispondere a qualsiasi domanda in essi nel campo del biochimica e della metodologia come un'analisi dei diritti di sviluppo nel nematode. Il principale vantaggio di questa tecnica è la precipitazione proteica nell'estroduzione e nella bevanda e l'omogeneizzazione dei vermi. Inizia questo esperimento coltivando il ceppo E.coli OP50 in 300 millilitri di mezzo liquido di brodo LB a 37 gradi Celsius durante la notte.Archiviare OP50 di successo a quattro gradi Celsius. Pipetta due millilitri dell'OP50 coltivato su almeno tre NGM precedentemente preparati, o Nematode Growth Media Agar Plates e spalmato a mano ruotando la piastra. Incubare le piastre a temperatura ambiente durante la notte per creare un sottile strato di OP50.Quindi, utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raccogliere un pezzo di agar da un piatto con vermi, per aggiungere almeno 100 vermi a ogni piastra NGM OP50. Coltura almeno tre piastre con i vermi a 20 gradi Celsius, fino a quando i vermi raggiungono lo stadio adulto, che è confermato al microscopio stereoscopico. Individua gli ermafroditi gravidi pieni di uova usando un microscopio stereoscopico.Dopo aver aggiunto cinque millilitri di S-buffer alle piastre, utilizzare la pipetta Pasteur per trasferire i vermi da tutte e tre le piastre a un tubo conico da 15 millilitri. Lavare i vermi tre volte aggiungendo 15 millilitri di S-buffer e quindi centrifugando a 300 volte G a temperatura ambiente per 30 secondi. Se il volume di S-buffer supera i cinque millilitri, rimuovere il buffer in eccesso dopo la centrifugazione.Per un'esonizzazione riuscita e l'isolamento delle uova sfuse, sciogliere i vermi in 0,5 millilitri di soluzione di ipoclorato alcalino. Mescolare invertendo e incubando a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Centrifugare a 1.400 giri/min per 30 secondi per rimuovere la soluzione.Utilizzare 15 millilitri di S-buffer per lavare il pellet di uova. Dopo la centrifugazione rimuovere il supernatante e ripetere questo lavaggio almeno tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendiamo il pellet in cinque o sei millilitri di S-buffer, senza E.coli e incubamo le uova durante la notte a 20 gradi Celsius per schiuderle e raggiungere la coltura sincrona H delle larve dello stadio L1.Pipetta 10 microlitri di tampone S contenenti vermi L1 su tre scivolamenti di copertura. Contare le larve al microscopio stereoscopico e calcolare la media per determinare il numero approssimativo di larve dello stadio L1. Infine, trasferisci le larve dello stadio L1 in cinque piastre Agar NGM con OP50 e coltivale a 20 gradi Celsius fino allo stadio del giovane adulto, durante il quale si verifica l'autofertilizzazione e vengono deposte alcune uova.Osserva i vermi ogni giorno al microscopio e poi raccogli i giovani vermi adulti o di cinque giorni. Per selezionare solo vermi viventi, aggiungere i vermi sospesi in tre o quattro millilitri di S-buffer a un tubo conico da 15 millilitri. Quindi aggiungere un volume uguale di saccarosio al 60% ghiacciato e mescolare.Centrifugare il tubo a 1.500 volte G a quattro gradi Celsius per 15 secondi. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur per spostare attentamente i vermi dalla parete del tubo, quindi rimuovere i vermi galleggianti in un tubo fresco. Riempire il tubo con S-buffer per lavare i vermi e centrifugare a 1500 volte G a quattro gradi Celsius per 30 secondi.Rimuovere il tampone e ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere con cura il supernatante, assicurandosi di non rimuovere alcun verme, e utilizzare una punta di pipetta da 1.000 microliter per misurare il volume umido dei vermi lavati. Per la precipitazione proteica, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere i vermi lavati a un volume uguale di acido tricloroacetico ghiacciato al 10% in un omogeneizzatore posto sul ghiaccio.Omogeneizzare utilizzando 40 tratti di passel con rotazione, fino a 1.300 giri/min. Utilizzare un omogeneizzatore ad ultrasuoni con ciclo di servizio del 20% per sonicare l'omogeneizzatore. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire l'omogeneato in un tubo da 1,5 millilitri posto sul ghiaccio.Dopo aver trasferito l'omogeneato in un tubo di micro centrifuga, centrifugare a 8.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti per chiarirlo. Trasferire il supernatante su un tubo fresco e aggiungere quattro cloruri di potassio molare e incubare sul ghiaccio per 20 minuti per neutralizzarlo. Quindi centrifugarlo a 8.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Trasferire il supernatante in un tubo fresco e conservare a 80 gradi Celsius fino a quando necessario per ulteriori test. Per misurare la concentrazione di lattato, utilizzare un kit di saggi colorimetrici per effettuare analisi duplicate per i campioni di prova. Aggiungere 10 microlitri dei campioni di prova a ciascun pozzo di una piastra da 96 porcili, quindi aggiungere il tampone di dosaggio del lattato a ciascun campione per regolare il volume a 15 microlitri.Diluire 100 millimolare L+Lattato Standard con tampone di dosaggio del lattato a un millimolare. Quindi, in una serie di pozzi, aggiungere zero, due, quattro, sei, otto e 10 microlitri di L+Lattato Standard diluito. Aggiungere 50 microlitri di miscela di reazione ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente protetta dalla luce per almeno 30 minuti affinché il colore si sviluppi.Infine, utilizzare un lettore di micropiastrine per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 570 nanometri. Sottrarre l'assorbanza della miscela di controllo dello sfondo dall'assorbanza della miscela di reazione. Quindi tracciare la curva standard del lattato e calcolare le concentrazioni di lattato dalla curva moltiplicando ogni concentrazione per 2,25.Utilizzare un kit di dosaggio colorimetrico per misurare la concentrazione di piruvato nei campioni di prova ed eseguire esami duplex. Aggiungere 10 microlitri dei campioni di prova a diversi pozzi di una piastra da 96 porri e aggiungere 90 microlitri di reagente funzionante a ciascun campione. Incubare coperto per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi posizionare la piastra nel lettore di micropiastrine per misurare l'assorbenza di ogni pozzo a 570 nanometri. Tracciare la curva standard del piruvato e calcolare le concentrazioni di piruvato dalla curva standard moltiplicando ogni concentrazione per 2,25. E infine, per misurare la concentrazione proteica nei campioni di prova, utilizzare un kit di saggi colorimetrici come descritto nel protocollo di testo.Dopo la precipitazione delle proteine, i saggi colorimetrici possono essere utilizzati per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato. Questo esperimento mostra l'accuratezza dei saggi colorimetrici contrari ai precedenti rapporti in C.Elegans. Inoltre, questi saggi sono sufficientemente sensibili da misurare le concentrazioni di lattato e piruvato anche in campioni su piccola scala in un breve periodo di tempo.Per rilevare con precisione lattato e piruvato in C.elegans, è fondamentale eseguire precipitazioni proteiche durante l'omogeneizzazione dei vermi. La quantità di lattato e piruvato rilevata è più elevata quando i campioni vengono precipitati in proteine durante l'omogeneizzazione, rispetto alla frazione citosolica intatta o dopo l'omogeneizzazione quando non è stato rilevato alcun lattato o piruvato.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

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