Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
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この作品は、角野ヤナセに大東文化大学から特別研究助成によって支えられた財政的に。

1. 同期c. の elegans文化
<ol><li>播種前、に文化エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 一晩 300 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) スープ液体培地で 37 ° C で OP50 を歪します。-4 ° C で培養 OP50 ストア<ol>
<li>LB スープ液体培地を作るため、1 N NaOH の 1.5 mL の塩化ナトリウム 10 g、酵母エキス 5 g トリプトン 10 g を使用して脱イオン水で 1 L に追加。オートクレーブ。 注: OP50 と線虫</...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

これらの比色アッセイ キットを利用して、細胞の乳酸を検出するサンプル抽出の最も重要なステップと正確にc. の elegansのピルビン酸は均質化 (図 1) の間に蛋白質の沈殿物の処理にです。厳密に他ホモジナイザーとしてテフロン ホモジナイザーを使用する必要はありません (e.g。、Dounce 組織グラインダー、またはビード ミルズをテーパーと) ワームの小規...

乳酸とピルビン酸の濃度は、エネルギー代謝の中間体として広くみなされ、解糖作用、トリカルボン酸 (TCA) サイクル、および好気性生物の細胞における電子輸送チェーンの状態に関連しています。一連の解糖系の反応は、グルコース代謝の岐路にあると糖新生、脂肪酸、アセチル coa、を介してエネルギー代謝を炭水化物とアミノ酸のアラニンに変換できるピルビン酸に酸化します。TCA サイクルは、糖のエネルギーへの変換のために基本的十分な溶存酸素の存在下で発生します。特に、二次代謝の変化は、エネルギー生産のため主に解糖系が使用されている興味深い現象と TCA サイクルと電子輸送鎖を含む、好気性のミトコンドリア呼吸はダウンレギュ レート哺乳類の癌細胞の1,2を実行します。我々 は最近モデル有機体線虫(C. elegans) の時効中における血中乳酸値とそれに伴う乳酸/ピルビン酸 (L/P) 比が減少したことを示した。同様に、 c. の elegansの哺乳類腫瘍のサプレッサー p53 オーソログ CEP 1 では、その転写制御ターゲット3の活性化を介してエネルギー代謝の加齢に伴う変化の重要な役割がわかった。
細胞の乳酸とピルビン酸濃度の測定などの生物学的アッセイでは、感度、精度、サンプル サイズ、および比色/蛍光アッセイ キットのインキュベーション時間が劇的に改善されています。技術革新のおかげで、我々 はその小さなサイズを与えられた困難であるさまざまな代謝産物や線虫の大規模な文化なし中間代謝物を分析することができるされます。一般に、比色定量法の感度は蛍光アッセイ; より小さい大きさの順序ただし、比色方法は、一般的な実験室の設定でより適しています。この線虫が外骨格に囲まれているのでさらに、均質化および蛋白質の沈殿物を含む抽出法は線虫の細胞に乳酸とピルビン酸濃度の定量のために重要哺乳類培養細胞ライン4、5とは異なり、キューティクルと呼ばれます。ここでは、線虫からサンプル抽出のためのヒントを含む商業比色アッセイ キットを使用して乳酸とピルビン酸の濃度を分析するプロトコルについて述べる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

乳酸とピルビン酸は、細胞内のエネルギー代謝の鍵中間体です。細胞における乳酸/ピルビン酸比の変化は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化と好気性解糖作用の間の加齢に伴うエネルギー代謝に不均衡があるかどうかを判断するのに役立ちます。ここでは、線虫モデル有機体の乳酸とピルビン酸の商業の比色アッセイ キットの使用率を表示します。最近、感度と比色/蛍光アッセイ キットの精度が大幅に改善されました研究試薬メーカーによる開発によって。改良された試薬は、線虫の 96 ウェル プレートでの小規模な試金の使用を有効にしています。一般的に、蛍光アッセイは感度よりも優れて比色試金;ただし、比色定量のアプローチは一般的な研究室での使用に適した。定量のためのこれらの試金のもう一つの重要な問題は、均質化のc. の elegansの蛋白質の沈殿物のサンプル。私たちのタンパク質の沈殿法、一般的な沈殿の (e.g。、トリクロロ酢酸、過塩素酸およびメタリン酸) サンプル調製に使用。無料の蛋白質の試金のサンプルは、均質化の中に直接冷たい鉛塩法 (最終濃度 5%) を追加することによって準備されます。

乳酸とピルビン酸濃度の定量比色試金を使用して、これらの試金はc. の elegans7,8以前のレポートと比較して精度を示した。ここでは、サンプル抽出中に蛋白質の沈殿物のプロセスは、正確な値を生成する最も重要なステップだった。蛋白質の沈殿物、一般的な沈殿のため (e.g。、TCA、PCA やメタリン酸) テスト サ...

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Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

変更された小規模な抽出と乳酸と線虫のピルビン酸の比色定量法について述べる線虫。商業アッセイ キットを利用するときの感度と精度の技術の開発が重要です。抽出の蛋白質の沈殿物は、細胞内の代謝物の定量法の最も重要なステップです。

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

この研究は、線虫の開発権の分析など、生化学数および方法論分野の質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ワームの外挿および飲料および均質化におけるタンパク質沈殿である。一晩で37°CでLBスープ液体培地の300ミリリットルで大腸菌OP50株を成長させることによって、この実験を開始します。成功したOP50を摂氏4度で保管してください。培養OP50のピペット2ミリリットルは、少なくとも3つの前に調製されたNGM、またはネマトード成長培地寒天プレートに、プレートを手で旋回して広がる。プレートを室温で一晩インキュベートし、OP50の薄い層を作り出します。次に、無菌爪楊枝を使用して、ワームを含むプレートから寒天の一部を選び、各OP50 NGMプレートに少なくとも100個のワームを追加します。ワームが成虫段階に達するまで、少なくとも3つのプレートを摂氏20度で培養し、立体顕微鏡で確認する。立体顕微鏡を使用して卵で満たされたグラヴィッド雌雄同体を見つけます。5ミリリットルのSバッファーをプレートに加えた後、パスツールピペットを使用して、3つのプレートすべてから15ミリリットルの円錐形チューブにワームを移します。15ミリリットルのSバッファを加え、室温で300倍Gで遠心分離機を30秒間加えて、ワームを3回洗います。Sバッファーの体積が5ミリリットルを超える場合は、遠心分離後の余分なバッファーを除去します。正常なエキソニゼーションとバルク卵の分離のために、0.5ミリリットルのアルカリ性低塩素酸溶液にワームを溶解します。室温で10~15分間、反転してインキュベートします。遠心分離機を1,400RPMで30秒間、溶液を除去した。卵ペレットを洗浄するためにSバッファーの15ミリリットルを使用してください。遠心分離後、上清を取り除き、この洗浄を少なくとも3回繰り返します。最後の洗浄後、大腸菌なしで5〜6ミリリットルのSバッファにペレットを吊り下げ、卵を20°Cで一晩インキュベートして孵化させ、L1ステージ幼虫のH同期培養を達成します。3つのカバースリップにL1ワームを含むSバッファーのピペット10マイクロリットル。立体顕微鏡で幼虫を数え、平均を計算してL1ステージ幼虫のおおよその数を求める。最後に、L1ステージの幼虫をOP50で5つのNGM寒天プレートに移し、若い成人期まで摂氏20度で成長させ、その間に自己受精が起こり、卵が数個産まれる。顕微鏡の下で毎日ワームを観察し、その後、若い成虫、または5日齢のワームを収集します。生きているワームのみを選択するには、Sバッファの3〜4ミリリットルに吊り下げられたワームを15ミリリットルの円錐形チューブに加えます。その後、氷冷60%スクロースの等量を追加し、ミックス。チューブを摂氏4度で1、500倍Gで15秒間遠心する。その後、パスツールピペットを使用して慎重にチューブの壁からワームを移動し、新鮮なチューブに浮遊ワームを除去します。チューブにSバッファを充填してワームを洗浄し、遠心分離機を摂氏4度で1500倍に30秒間充填します。バッファーを取り外し、さらに2回洗浄を繰り返します。3回目の洗浄後、上清を慎重に除去し、ワームを除去しないようにし、洗浄されたワームの湿潤体積を測定するために1,000マイクロリットルピペットチップを使用します。タンパク質沈殿の場合は、パスツールピペットを使用して、洗浄されたワームを氷の上に置かれたホモジナイザーの氷冷10%トリクロロ酢酸の等量に加えます。回転で40ストロークのパッセルを使用して均質化し、最大1,300 RPM。ホモジネートを超音波処理するために20%デューティサイクルで超音波ホモジナイザーを使用してください。パスツールピペットを使用して、ホモジネートを氷の上に置かれた1.5ミリリットルのチューブに移します。ホモジネートをマイクロ遠心管に移した後、それを明確にするために摂氏4度で8,000時間Gの遠心分離機を10分間分とした。上清を新鮮なチューブに移し、4つの塩化カリウムを加え、氷の上で20分間インキュベートして中和します。その後、摂氏4度で8,000倍Gで10分間遠心分離します。上清を新鮮なチューブに移し、さらにアッセイが必要になるまで摂氏80度で保管します。乳酸塩の濃度を測定するには、測色測定キットを使用して、試験サンプルの重複分析を行います。96ウェルプレートの各ウェルに10マイクロリットルの試験サンプルを加え、各サンプルに乳酸アッセイバッファーを加えて、体積を15マイクロリットルに調整します。乳酸アッセイバッファーを1ミリモルに100ミリモルL+乳酸塩標準で希釈します。次に、一連のウェルに、希釈されたL +乳酸塩標準のゼロ、2、4、6、8、および10マイクロリットルを加えます。各ウェルに50マイクロリットルの反応ミックスを加え、光から保護された室温で少なくとも30分間インキュベートして色が現れます。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、570ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。反応ミックスの吸光度からバックグラウンドコントロールミックスの吸光度を差し引きます。次に乳酸塩標準曲線をプロットし、各濃度に2.25を掛けて曲線から乳酸塩濃度を計算します。着色測定アッセイキットを使用して、試験サンプル中のピルビン酸濃度を測定し、二重検査を実施します。96ウェルプレートの異なる井戸に10マイクロリットルの試験サンプルを加え、各サンプルに90マイクロリットルの作業試薬を加えます。室温で30分間包むインキュベート。その後、プレートをマイクロプレートリーダーに入れ、570ナノメートルで各ウェルの吸収性を測定します。ピルビン酸標準曲線をプロットし、各濃度に2.25を掛けて標準曲線からピルビン酸濃度を計算します。そして最後に、試験サンプル中のタンパク質濃度を測定するために、テキストプロトコルに記載されているように、色分けアッセイキットを用いる。タンパク質沈殿後、乳酸およびピルビン酸濃度の定量的測定に対して、着色アッセイを用いることができる。この実験は、C.Elegansの以前の報告に反する比色アッセイの精度を示しています。さらに、これらのアッセイは、短期間で少量サンプル中でも乳酸塩およびピルビン酸濃度を測定するのに十分に敏感である。C.elegansで乳酸およびピルビン酸塩を正確に検出するには、ワームの均質化中にタンパク質沈殿を行うことが重要です。乳酸塩およびピルビン酸の検出量は、サンプルが均質化中にタンパク質沈殿した場合、乳酸塩またはピルビン酸がまったく検出されなかった場合に均一化した後の無傷の細胞質分画と比較して高くなります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

セルロース紙ディスクおよび裸眼比色イムノアッセイにおけるそれらのアプリケーションへの抗体の共有結合

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As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

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ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

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