Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av en spesiell forskningsstipend fra Daito Bunka University til Sumino Yanase.

1. synkronisert kultur C. elegans
<ol><li>Før Såing, kultur Escherichia coli (E. coli) belastning OP50 over natten på 37 ° C i 300 mL av Luria-Bertani (LB) kjøttkraft flytende medium. Lagre den kultiverte OP50 på-4 ° C.<ol>
<li>For å være LB kjøttkraft flytende medium, bruk 10 g av tryptone, 5 g av gjærekstrakt, 10 g av NaCl og 1,5 mL 1 N NaOH, og legge til 1 L med deionisert vann. Autoclave. Merk: OP50 og C. elegans stammer er tilgjengelig fra Caenorhabditis genetikk C...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

Når utnytte disse kolorimetrisk analysen kits, er det viktigste trinnet i prøven utvinning å oppdage mobilnettet laktat og pyruvate nøyaktig i C. elegans prosessen med protein nedbør i løpet homogenisering (figur 1). Det er ikke strengt nødvendig å bruke en Teflon homogenizer, som andre homogenizers (f.eks., Dounce og konisk vev kverner eller perle mills) er også egnet til småskala utvinning av ormer. Vi gjorde ikke merker mobilnettet laktat og pyruvate i test pr?...

Laktat og pyruvate konsentrasjoner er ansett som intermediates av energi metabolism, og er knyttet til USA Glykolysen, tricarboxylic syre (TCA) syklus og elektronet transportkjeden i cellene i aerobic organismer. En rekke reaksjoner i Glykolysen oksidere glukose til pyruvate, som ligger ved en metabolsk veiskille og kan konverteres karbohydrater gjennom Glukoneogenesen, fettsyrer og energi metabolisme gjennom acetyl-CoA og aminosyre alanin. TCA syklus oppstår under tilstedeværelsen av tilstrekkelig oppløst oksygen og er grunnleggende for konvertering av glukose til energi. Spesielt, endring av sekundær metabolismen er et interessant fenomen der Glykolysen brukes hovedsakelig for energiproduksjon og aerobic mitokondrie åndedrett, som innebærer TCA syklus og elektronet transportkjeden, er downregulated i pattedyr kreft celler1,2. Vi viste nylig at laktat nivåer og påfølgende laktat/pyruvate (L/P) forholdet minket i aldring i modellen organismen Caenorhabditis elegans (C. elegans). Likeledes, vi fant at pattedyr tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en viktig rolle i alder-relaterte endringer av energi metabolism gjennom aktivering av det transcriptional mål3.
I biologiske metoder, for eksempel måling av laktat og pyruvate konsentrasjoner i celler, forbedret følsomhet, nøyaktighet, utvalgsstørrelsen og inkubasjon tid kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits dramatisk. På grunn av teknologiske nyvinninger er vi nå kjøpedyktig analysere ulike metabolitter og mellomliggende metabolitter uten store kultur C. elegans, som er vanskelig gitt sin lille størrelse. Vanligvis er følsomheten til en kolorimetrisk analysen en størrelsesorden som er mindre enn en fluorimetric analysen; kolorimetrisk tilnærming er imidlertid mer egnet i innstilling felles laboratorier. Videre er en utvinning teknikk som inneholder homogenisering og protein nedbør avgjørende for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate konsentrasjoner i C. elegans celler fordi denne Rundormer er omsluttet av en ytre skjelett kalt cuticle, i motsetning til pattedyr kulturperler cellen linjer4,5. Her beskriver vi en protokoll for å analysere laktat og pyruvate konsentrasjoner bruke kommersielle kolorimetrisk analysen prosjektpakker inkludert tips for eksempel utvinning fra C. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Laktat og pyruvate er viktige intermediates av intracellulær energi metabolske veier. Overvåking laktat/pyruvate forholdet i celler bidrar til å avgjøre om det er en ubalanse i alder-relaterte energi metabolism mellom mitokondrie oxidative fosforylering og aerobic Glykolysen. Her viser vi utnyttelsen av kommersielle kolorimetrisk analysen kits for laktat og pyruvate i modellen organismen C. elegans. Nylig forbedret den sensitivitet og nøyaktigheten av kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits mye av forskning og utvikling utført av reagens produsenter. Forbedret reagensene har aktivert bruk av småskala analyser med en 96-brønns plate i C. elegans. Generelt, er en fluorimetric analysen overlegen i følsomhet en kolorimetrisk analysen; Imidlertid er kolorimetrisk tilnærmingen mer egnet for bruk i vanlige laboratorier. I disse analyser for kvantitative besluttsomhet er protein utfelling av homogenisert C. elegans prøver. I vår protein nedbør metode, felles precipitants (f.eks., Trekloredikksyre, perchloric syre og metaphosphoric syre) brukes for eksempel forberedelse. En protein-fri analysen prøven er utarbeidet av direkte legge kaldt precipitant (siste konsentrasjon på 5%) under homogenisering.

Bruker de kolorimetrisk analyser for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate konsentrasjoner, viste vi nøyaktigheten av disse analyser sammenlignet med tidligere rapporter i C. elegans7,8. Her var prosessen med protein nedbør i prøven utvinning det mest avgjørende skrittet å generere nøyaktige verdier. For protein nedbør, felles precipitants (f.eks., TCA, PCA, eller metaphosphoric acid) kan brukes ...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Vi beskriver en modifisert småskala utvinning og kolorimetrisk analyser av laktat og pyruvate i Rundormer C. elegans. Når utnytte kommersiell analyse kits, er den tekniske utviklingen av deres følsomhet og nøyaktighet viktig. Protein nedbør i utvinning er det viktigste steget for kvantitative fastsettelse av intracellulær metabolitter.

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Denne forskningen kan bidra til å svare på eventuelle spørsmål i dem biokjemisk antall og metodikk felt som en analyse av utviklingsrettigheter i nematode. Den største fordelen med denne teknikken er proteinnedbørning i ekstraduksjon og drikke og homogenisering av ormene. Start dette eksperimentet ved å vokse E.coli OP50 belastning i 300 milliliter LB kjøttkraft flytende medium ved 37 grader Celsius over natten.Lagre vellykket OP50 på fire grader Celsius. Pipette to milliliter av den kultiverte OP50 på minimum tre tidligere forberedt NGM, eller Nematode Growth Media Agar Plates og spredt for hånd virvlende platen. Inkuber platene ved romtemperatur over natten for å skape et tynt lag med OP50.Deretter bruker du en steril tannpirker til å velge et stykke agar fra en tallerken med ormer, for å legge til minst 100 ormer til hver OP50 NGM-plate. Kultur minst tre plater med ormene ved 20 grader Celsius, til ormene når voksenstadiet, som bekreftes under stereoskopisk mikroskop. Finn gravid hermafroditter fylt med egg ved hjelp av et stereoskopisk mikroskop.Etter å ha lagt til fem milliliter S-buffer til plater, bruk Pasteur pipette til å overføre ormene fra alle tre platene til et konisk rør på 15 milliliter. Vask ormene tre ganger ved å legge til 15 milliliter S-buffer og deretter sentrifuging ved 300 ganger G ved romtemperatur i 30 sekunder. Hvis volumet av S-buffer overstiger fem milliliter, fjerner du overflødig buffer etter sentrifugering.For vellykket eksonisering og bulk egg isolasjon, oppløse ormene i 0,5 milliliter alkalisk hypoklorat løsning. Bland ved å invertere og inkubere ved romtemperatur i 10 til 15 minutter. Sentrifuge ved 1, 400 O/MIN i 30 sekunder for å fjerne oppløsningen.Bruk 15 milliliter S-buffer til å vaske eggpelleten. Etter sentrifugering fjerner den overnatanten og gjentar denne vasken minst tre ganger. Etter den siste vasken suspenderer vi pelleten i fem til seks milliliter S-buffer, uten E.coli og inkubere eggene over natten ved 20 grader Celsius for å klekke dem og oppnå H synkron kultur av L1-scenelarver.Pipette 10 mikroliter S-buffer som inneholder L1 ormer på tre dekselslips. Tell larver under et stereoskopisk mikroskop og beregn gjennomsnittet for å bestemme omtrentlig antall L1-trinns larver. Til slutt overfører L1-scenen larver til fem NGM Agar Plates med OP50 og vokser dem ved 20 grader Celsius til den unge voksne scenen, hvor selvbefruktning oppstår og noen egg legges.Vær oppmerksom på ormene hver dag under mikroskopet og samle deretter den unge voksne, eller fem dagers gamle ormer. For å velge bare levende ormer, legg til ormene suspendert i tre til fire milliliter S-buffer til et konisk rør på 15 milliliter. Tilsett deretter et likt volum iskald 60% sukrose og bland.Sentrifuger røret ved 1, 500 ganger G ved fire grader Celsius i 15 sekunder. Bruk deretter en Pasteur pipette til å forsiktig flytte ormene av rørveggen, og fjern deretter de flytende ormene i et friskt rør. Fyll røret med S-buffer for å vaske ormene, og sentrifuge ved 1500 ganger G ved fire grader Celsius i 30 sekunder.Fjern bufferen og gjenta vasken to ganger til. Etter den tredje vasken, fjern forsiktig det overnaturlige, pass på at du ikke fjerner ormer, og bruk en 1000 mikroliter pipettespiss for å måle det våte volumet av de vasket ormene. For proteinnedbør, bruk en Pasteur pipette for å legge til de vasket ormene til et likt volum iskald 10% trikloreddiksyre i en homogenisator plassert på is.Homogenisere ved hjelp av 40 slag passel med rotasjon, opptil 1, 300 RPM. Bruk en ultralyd homogenisator med 20% plikt syklus for å sonikere homogenatet. Bruk en Pasteur pipette til å overføre homogenatet til 1,5 milliliter rør plassert på is.Etter overføring av homogenatet til et mikrosentrigerrør, sentrifuge ved 8000 gang G ved fire grader Celsius i 10 minutter for å klargjøre det. Overfør det overnaturlige til et friskt rør og tilsett fire molarkaliumklorid og inkuber på is i 20 minutter for å nøytralisere den. Deretter sentrifuge det på 8, 000 ganger G på fire grader Celsius i 10 minutter.Overfør supernatanten til et friskt rør og lagre på 80 grader Celsius til det trengs for ytterligere analyser. For å måle konsentrasjonen av laktat, bruk et kolorimetrisk analysesett til å utføre dupliserte analyser for testprøvene. Tilsett 10 mikroliter av testprøvene i hver brønn av en 96-brønns plate, og legg deretter laktatanalysebuffer til hver prøve for å justere volumet til 15 mikroliter.Fortynn 100 millimolar L+LaktatStandard med laktatanalysebuffer til én millimolar. Deretter, inn i en rekke brønner, legg til null, to, fire, seks, åtte og 10 mikroliter fortynnet L + Laktat Standard. Tilsett 50 mikroliter reaksjonsblanding til hver brønn, og inkuber ved romtemperatur beskyttet mot lys i minst 30 minutter for at fargen skal utvikle seg.Til slutt bruker du en mikroplateleser til å måle absorbansen til hver brønn på 570 nanometer. Trekk absorpsjonen av bakgrunnskontrollblandingen fra reaksjonsblandingens absorbans. Deretter plotter du laktatstandardkurven, og beregner laktatkonsentrasjonene fra kurven ved å multiplisere hver konsentrasjon med 2,25.Bruk et kolorimetrisk analysesett for å måle konsentrasjonen av pyruvat i testprøvene, og utfør dupleksundersøkelser. Tilsett 10 mikroliter av testprøvene til forskjellige brønner av en 96-brønns plate, og tilsett 90 mikroliter arbeidsreagens til hver prøve. Inkuber dekket i 30 minutter ved romtemperatur.Plasser deretter platen i mikroplateleseren for å måle absorbensen til hver brønn ved 570 nanometer. Plott pyruvatstandardkurven, og beregn pyruvatkonsentrasjonene fra standardkurven ved å multiplisere hver konsentrasjon med 2,25. Og til slutt, for å måle proteinkonsentrasjonen i testprøvene, bruk et kolorimetrisk analysesett som beskrevet i tekstprotokollen.Etter proteinnedbørs kan kolorimetriske analyser brukes til kvantitativ bestemmelse av laktat- og pyruvatkonsentrasjoner. Dette eksperimentet viser nøyaktigheten av kolorimetriske analyser i strid med tidligere rapporter i C.Elegans. Videre er disse analysene tilstrekkelig følsomme for å måle laktat- og pyruvatkonsentrasjoner selv i småskalaprøver på kort tid.For å nøyaktig oppdage laktat og pyruvat i C.elegans, er det avgjørende å utføre proteinnedbørning under homogenisering av ormene. Mengden laktat og pyruvat som oppdages er høyere når prøver er proteinutfelt under homogenisering, sammenlignet med intakt cytosolisk fraksjon eller etter homogenisering når det ikke var laktat eller pyruvat oppdaget i det hele tatt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Kovalent Binding av antistoffer til cellulosepapir plater og deres applikasjoner i Naked-eye Kolorimetriske Immunoassays

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kartlegging metabolisme: Overvåking laktat Dehydrogenase aktivitet direkte i vev

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometri fastsettelse av Phycobiliprotein innhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-baserte stor skala dyrking av Caenorhabditis elegans: Sample forberedelse for studiet av metabolske forandringer i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...