Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma bolsa de investigação especial de Daito Bunka University para Sumino Yanase.

1. sincronizada cultura de c. elegans
<ol><li>Antes da semeadura, cultura de Escherichia coli (e. coli) estirpe OP50 durante a noite a 37 ° C em 300 mL de meio líquido de caldo de Luria-Bertani (LB). Armazenar o OP50 cultivadas a-4 ° C.<ol>
<li>Para tornar o meio líquido do caldo LB, usar 10g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de 1 NaOH de N e adicionar a 1 L com água desionizada. Autoclave. Nota: OP50 e c. elegans cepas estão disponíveis a parti...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

Utilizando esses kits de ensaio colorimétrico, o passo mais crítico na extração de amostra para detectar celular lactato e piruvato com precisão em c. elegans são o processo de precipitação de proteínas durante a homogeneização (Figura 1). Não é estritamente necessário usar um homogeneizador de Teflon, como outros Homogeneizadores (EG., homogenizacao e afilado moedores de tecido, ou moinhos do grânulo) também são adequados à extração artesanal de vermes....

Concentrações de lactato e piruvato são amplamente consideradas como intermediários do metabolismo energético e relacionam-se aos Estados da glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte electrónico, nas células de organismos aeróbios. Uma série de reações na glicólise oxidar a glicose em piruvato, que se encontra numa encruzilhada metabólica e pode ser convertido para hidratos de carbono através da gluconeogénese, ácidos graxos e metabolismo energético através de acetil-CoA e a aminoácido alanina. O ciclo TCA ocorre sob a presença de oxigênio dissolvido suficiente e é fundamental para a conversão de glicose em energia. Especialmente, a alteração do metabolismo secundário é um fenômeno interessante na qual glicólise é usado predominantemente para produção de energia e aeróbia respiração mitocondrial, que envolve o ciclo TCA e cadeia de transporte de elétrons, é ativador em mamíferos câncer células1,2. Nós mostramos recentemente que os níveis de lactato e a relação lactato/piruvato consequente (L/P) diminuiu durante o envelhecimento no organismo modelo Caenorhabditis elegans (c. elegans). Da mesma forma, achamos que os mamíferos tumor supressor p53 ortholog CEP-1 em c. elegans tem um papel importante nas alterações relacionadas com a idade do metabolismo energético através da ativação de seus alvos transcricionais3.
Em ensaios biológicos, tais como a medição das concentrações de lactato e piruvato em células, a sensibilidade, precisão, tamanho da amostra e tempo de incubação de kits de ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram dramaticamente. Devido às inovações tecnológicas, agora somos capazes de analisar vários metabólitos e metabólitos intermediários sem a cultura em grande escala de c. elegans, que é difícil, dado o seu pequeno tamanho. Em geral, a sensibilidade de um ensaio colorimétrico é uma ordem de magnitude menor do que um ensaio fluorimétrica; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais adequada na configuração dos laboratórios comuns. Além disso, uma técnica de extração contendo precipitação de homogeneização e proteína é crucial para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato de células de c. elegans , porque este nematódeo é encerrado em um exoesqueleto chamado a cutícula, ao contrário de células de mamíferos cultivadas linhas4,5. Aqui, descrevemos um protocolo para analisar as concentrações de lactato e piruvato usando kits de ensaio colorimetric comercial, incluindo dicas para extração de amostra de c. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Lactato e piruvato são chaves intermediários de vias metabólicas de energia intracelular. A relação lactato/piruvato em células de monitoramento ajuda a determinar se há um desequilíbrio no metabolismo de energia relacionadas com a idade entre a fosforilação oxidativa mitocondrial e glicólise aeróbica. Aqui, nós mostramos a utilização de kits de ensaio colorimetric comercial para lactato e piruvato no organismo modelo c. elegans. Recentemente, a sensibilidade e a precisão dos kits ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram grandemente pela pesquisa e desenvolvimento realizados por fabricantes de reagente. Os reagentes melhorados permitiram o uso de ensaios de pequena escala com uma placa de 96 poços em c. elegans. Em geral, um ensaio fluorimétrica é superior na sensibilidade de um ensaio colorimétrico; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais apropriada para o uso em laboratórios comuns. Outra questão importante nestes ensaios para a determinação quantitativa é a precipitação de proteínas do homogeneizado c. elegans amostras. Em nosso método de precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., ácido tricloroacético, ácido perclórico e ácido metafosfórico) são utilizados para a preparação da amostra. Uma amostra de ensaio livre de proteína é preparada adicionando diretamente dessensibilizador frio (concentração final de 5%) durante a homogeneização.

Usando os ensaios colorimétricos para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato, mostramos a precisão destes ensaios em comparação com os relatórios anteriores em c. elegans7,8. Aqui, o processo de precipitação de proteínas durante a extração da amostra foi a etapa mais crucial para gerar valores precisos. Para a precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., TCA, PC...

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Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Esta pesquisa pode ajudar a responder a quaisquer perguntas neles na contagem de bioquímicos e no campo da metodologia, como a análise dos direitos de desenvolvimento no nematoide. A principal vantagem dessa técnica é a precipitação proteica na extradução e bebida e homogeneização dos vermes. Inicie este experimento cultivando a cepa E.coli OP50 em 300 mililitros de caldo LB médio líquido a 37 graus Celsius durante a noite.Armazene op50 bem sucedido a quatro graus Celsius. Pipeta dois mililitros do op50 cultivado no mínimo três NGM previamente preparado, ou Placas de Agar de Mídia de Crescimento Nematode e espalhados à mão girando a placa. Incubar as placas à temperatura ambiente durante a noite para criar uma fina camada de OP50.Em seguida, use um palito estéril para escolher um pedaço de ágar de uma placa com vermes, para adicionar pelo menos 100 worms a cada placa OP50 NGM. Cultura pelo menos três placas com os vermes a 20 graus Celsius, até que os vermes cheguem ao estágio adulto, o que é confirmado sob microscópio estereoscópico. Localize hermafroditas gravid cheias de ovos usando um microscópio estereoscópico.Depois de adicionar cinco mililitros de tampão S às placas, use a pipeta Pasteur para transferir os vermes das três placas para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os vermes três vezes adicionando 15 mililitros de S-buffer e, em seguida, centrifugando a 300 vezes G à temperatura ambiente por 30 segundos. Se o volume de tampão S exceder cinco mililitros, remova o excesso de buffer após a centrifugação.Para exonização bem sucedida e isolamento de ovos a granel, dissolva os vermes em 0,5 mililitros de solução alcalina de hipo clorato. Misture invertendo e incubando à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Centrifugar a 1.400 RPM por 30 segundos para remover a solução.Use 15 mililitros de tampão-S para lavar a pelota de ovo. Depois de centrifuá-lo remova o supernasce e repita esta lavagem pelo menos três vezes. Após a última lavagem, suspendemos a pelota em cinco a seis mililitros de S-buffer, sem E.coli e incubamos os ovos durante a noite a 20 graus Celsius para eclodi-los e alcançar a cultura síncrona H de larvas de estágio L1.Pipeta 10 microliters de S-buffer contendo worms L1 em três deslizamentos de tampa. Conte as larvas sob um microscópio estereoscópico e calcule a média para determinar o número aproximado de larvas do estágio L1. Finalmente, transfira as larvas do estágio L1 para cinco placas de NGM Agar com OP50 e plante-as a 20 graus Celsius até a fase adulta jovem, durante a qual ocorre a auto-fertilização e alguns ovos são colocados.Observe os vermes todos os dias sob o microscópio e, em seguida, colete o jovem adulto, ou vermes de cinco dias de idade. Para selecionar apenas vermes vivos, adicione os vermes suspensos em três a quatro mililitros de tampão-S a um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione um volume igual de sacarose gelada de 60% e misture.Centrifugar o tubo a 1.500 vezes G a 4 graus Celsius por 15 segundos. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para mover cuidadosamente os vermes da parede do tubo, e, em seguida, remover os vermes flutuantes em um tubo fresco. Encha o tubo com tampão S para lavar os vermes, e centrífuga a 1500 vezes G a quatro graus Celsius por 30 segundos.Retire o buffer e repita a lavagem mais duas vezes. Após a terceira lavagem, remova cuidadosamente o supernascer, certificando-se de não remover nenhum verme, e use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter para medir o volume úmido dos vermes lavados. Para precipitação proteica, use uma pipeta Pasteur para adicionar os vermes lavados a um volume igual de ácido 10% tricloroacético em um homogeneizador colocado no gelo.Homogeneize usando 40 traçados de passel com rotação, até 1.300 RPM. Use um homogeneizador ultrassônico com ciclo de 20% de dever para sonicar o homogeneizado. Use uma pipeta Pasteur para transferir o tubo homogeneado para 1,5 mililitro colocado no gelo.Depois de transferir o homogeneizado para um tubo de micro centrífuga, centrífuga a 8.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos para esclarecê-lo. Transfira o supernante para um tubo fresco e adicione quatro cloreto de potássio molar e incubar no gelo por 20 minutos para neutralizá-lo. Em seguida, centrifuá-lo a 8.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos.Transfira o supernante para um tubo fresco e armazene a 80 graus Celsius até que seja necessário para mais ensaios. Para medir a concentração de lactato, utilize um kit de ensaio colorimétrico para realizar análises duplicadas para as amostras de ensaio. Adicione 10 microliters das amostras de ensaio a cada poço de uma placa de 96 poços e, em seguida, adicione o tampão de ensaio de lactato a cada amostra para ajustar o volume a 15 microliters.Diluir 100 milimólares L+Lactato Padrão com tampão de ensaio de lactato para um milimiliar. Em seguida, em uma série de poços, adicione zero, dois, quatro, seis, oito e 10 microliters de L+Lactate Standard diluído. Adicione 50 microliters de mistura de reação a cada poço, e incubar à temperatura ambiente protegido da luz por pelo menos 30 minutos para que a cor se desenvolva.Por fim, use um leitor de microplacão para medir a absorção de cada poço em 570 nanômetros. Subtraia a absorvância da mistura de controle de fundo a partir da absorvância da mistura de reação. Em seguida, plote a curva padrão de lactato e calcule as concentrações de lactato da curva multiplicando cada concentração por 2,25.Use um kit de ensaio colorimétrico para medir a concentração de piruvato nas amostras de teste e realize exames duplex. Adicione 10 microliters das amostras de teste a diferentes poços de uma placa de 96 poços, e adicione 90 microliters de reagente de trabalho a cada amostra. Incubar coberto por 30 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, coloque a placa no leitor de microplacões para medir a absorção de cada poço em 570 nanômetros. Plote a curva padrão do piruvato e calcule as concentrações do piruvato a partir da curva padrão multiplicando cada concentração por 2,25. E, finalmente, para medir a concentração de proteína nas amostras de teste, use um kit de ensaio colorimétrico conforme descrito no protocolo de texto.Após a precipitação proteica, os ensaios colorimétricos podem ser usados para a determinação quantitativa das concentrações de lactato e piruvato. Este experimento mostra a precisão dos ensaios colorimétricos contrários aos relatórios anteriores em C.Elegans. Além disso, esses ensaios são suficientemente sensíveis para medir concentrações de lactato e piruvato, mesmo em amostras de pequena escala em um curto período de tempo.Para detectar com precisão lactato e piruvato em C.elegans, é crucial realizar precipitação proteica durante a homogeneização dos vermes. A quantidade de lactato e piruvato detectados é maior quando as amostras são progaméticas precipitadas durante a homogeneização, em comparação com a fração citosolica intacta ou após a homogeneização quando não havia lactato ou piruvato detectado.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

A ligação covalente de anticorpos para celulose discos de papel e suas aplicações em visível a olho nu colorimétricos imunoensaios

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Bioquímica

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

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Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

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Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

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Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...