Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Эта работа была финансово поддержана специальный исследовательский грант от Дайто Бунка университета для Сумино Янасэ.

1. синхронизированные культуры C. elegans
<ol><li>Перед посевом, культура Escherichia coli (E. coli) штамма ОР50 на ночь при 37 ° C в 300 мл жидкой среды бульон Бертани Лурия (LB). Магазин искусственный ОР50-4 ° c.<ol>
<li>Чтобы сделать LB отвара жидкой среды, используйте 10 g Триптон, 5 г экстракта дрожжей, 10 ?...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

При использовании этих колориметрических пробирного наборы, наиболее важным этапом в пример извлечения для обнаружения клеточных лактата и пирувата точно в C. elegans является процесс белка осадков во время гомогенизации (рис. 1). Это не строго необходимо использовать ...

Концентрации лактата и пирувата широко рассматривается как промежуточные энергии метаболизма и связаны в Штаты гликолиза, цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и электрон-транспортной цепи в клетках аэробных организмов. Серию реакций в гликолизе окисления глюкозы пируват, который находится на перепутье метаболических и могут быть преобразованы для углеводов через глюконеогенез, жирных кислот и метаболизм энергии через ацетил-КоА и аминокислота аланин. TCA цикл происходит при наличии достаточного количества растворенного кислорода и является основополагающим для преобразования глюкозы энергии. Особенно изменение вторичного метаболизма является интересным феноменом, в котором гликолиз используется преимущественно для производства энергии и аэробных митохондриальное дыхание, который включает цикл ТСА и электрон-транспортной цепи, downregulated в млекопитающих рака клеток в1,2. Недавно мы показали, что уровень лактата и последующее лактата в пирувата (L/P) соотношение уменьшилось во время старения в организме модель Caenorhabditis elegans (C. elegans). Аналогичным образом мы обнаружили, что млекопитающих опухоли ortholog подавитель p53 ВИС-1 в C. elegans имеет важную роль в возрастных изменений метаболизма энергии путем активации его транскрипционный анализ цели3.
В биологических анализов, например измерения концентрации лактата и пирувата в клетках чувствительность, точность, размер выборки и время инкубации колориметрии/Флуориметрическое пробирного комплектов были улучшены резко. Благодаря технологическим новшествам теперь мы можем анализировать различные метаболиты и промежуточных метаболитов без крупномасштабных культуры C. elegans, который трудно, учитывая ее небольшие размеры. В общем чувствительность колориметрического анализа является на порядок меньше, чем Флуориметрическое анализа; Однако колориметрические подход больше подходит в установлении общих лабораториях. Кроме того метод извлечения, содержащие гомогенизации и белка осадков имеет решающее значение для количественного определения концентраций лактата и пирувата в C. elegans клетки, потому что этот нематода заключена в экзоскелет под названием кутикулы, в отличие от mammalian клетки культивировали линии4,5. Здесь мы описываем протокол для анализа концентрации лактата и пирувата, с помощью коммерческих колориметрического анализа комплектов, включая советы для извлечения образца из C. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Лактата и пирувата являются ключевыми интермедиатов внутриклеточных энергии метаболических. Мониторинг соотношения молочной кислоты/пирувата в клетках помогает определить, является ли есть дисбаланс в метаболизме энергии, связанных с возрастом между митохондриальной окислительного фосфорилирования и аэробного гликолиза. Здесь мы покажем использование коммерческих колориметрического анализа комплектов для лактата и пирувата в организме модель C. elegans. Недавно чувствительность и точность колориметрии/Флуориметрическое пробирного наборы были значительно улучшилось, научных исследований и разработок, проводимых производителями реагента. Улучшенная реагентов позволили использование мелких анализов с 96-луночных пластины в C. elegans. В общем Флуориметрическое пробирного превосходит в чувствительности колориметрического анализа; Однако колориметрические подход больше подходит для использования в общих лабораториях. Еще одним важным вопросом в этих анализов для количественного определения является белок осадков гомогенизированные C. elegans образцы. В методе осадков белок, общие выделений (например., трихлоруксусная кислота, хлорной кислоты и metaphosphoric кислоты) используются для пробоподготовки. Бесплатно белка пробирного образец готовится непосредственно добавив холодной осадителя (конечной концентрации 5%), во время гомогенизации.

С помощью колориметрических анализов для количественного определения концентрации лактата и пирувата, мы показали точность этих анализов, по сравнению с предыдущими докладами в C. elegans7,,8. Здесь процесс белка осадков во время извле?...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мы описываем изменение мелкомасштабной добычи и колориметрические анализов лактата и пирувата в нематода C. elegans. При использовании коммерческих пробирного наборы, техническое развитие их чувствительность и точность имеет важное значение. Осадков белок в добыче является наиболее важным этапом для количественного определения внутриклеточных метаболитов.

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Это исследование может помочь ответить на любые вопросы в них биохимии кол и методологии области, такие как анализ прав на разработку в нематод. Основным преимуществом этой техники является белковые осадки в экстрадукции и питье и гомогенизации червей. Начните этот эксперимент с выращивания штамма E.coli OP50 в 300 миллилитров жидкой среды бульона LB при 37 градусах Цельсия за одну ночь.Храните успешный OP50 при четырех градусах цельсия. Pipette два миллилитров культурных OP50 как минимум на трех ранее подготовленных NGM, или Nematode Рост Сми Агар плиты и распространение вручную закрученного пластины. Инкубировать пластины при комнатной температуре на ночь, чтобы создать тонкий слой OP50.Затем используйте стерильную зубочистку, чтобы выбрать кусок агара из тарелки с червями, чтобы добавить не менее 100 червей к каждой пластине OP50 NGM. Культура по крайней мере три пластины с червями при 20 градусов по Цельсию, пока черви не достигнут стадии взрослого, что подтверждается под стереоскопическим микроскопом. Найдите гравидные гермафродиты, наполненные яйцами, с помощью стереоскопического микроскопа.После добавления пяти миллилитров S-буфера к пластинам, используйте Пастер пипетку для передачи червей из всех трех пластин в 15 миллилитров конической трубки. Вымойте червей три раза, добавив 15 миллилитров S-буфера, а затем центрифугирования при 300 раз G при комнатной температуре в течение 30 секунд. Если объем S-буфера превышает пять миллилитров, удалите избыточный буфер после центрифугирования.Для успешной экзонизации и массовой изоляции яйцеклеток растворите червей в 0,5 миллилитров щелочного раствора хлората гипо. Смешайте путем инвертирования и инкубации при комнатной температуре в течение 10 до 15 минут. Центрифуга при 1400 об/мин в течение 30 секунд, чтобы удалить раствор.Используйте 15 миллилитров S-буфера для мытья яичных гранул. После центрифугирования его удалить супернатант и повторить эту стирку по крайней мере три раза. После последней стирки, мы приостанавливаем гранулы в пять-шесть миллилитров S-буфера, без E.coli и инкубировать яйца на ночь при 20 градусах по Цельсию, чтобы вылупиться из них и достичь H синхронной культуры личинок стадии L1.Pipette 10 микролитров S-буфера, содержащего червей L1 на трех крышках скользит. Подсчитайте личинки под стереоскопическим микроскопом и вычислите среднее значение, чтобы определить приблизительное количество личинок стадии L1. Наконец, перенесите личинки стадии L1 на пять NGM Agar Plates с OP50 и выращивайте их при 20 градусах Цельсия до стадии молодого взрослого, во время которой происходит самоудобрение и откладываются несколько яиц.Наблюдайте за червями каждый день под микроскопом, а затем собирать молодых взрослых, или пятидневных червей. Чтобы выбрать только живых червей, добавить червей приостановлено в три-четыре миллилитров S-буфера в 15 миллилитров конической трубки. Затем добавьте равный объем ледяной 60% сахарозы и перемешайте.Центрифуга трубки при 1500 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 15 секунд. Затем используйте пипетку Pasteur, чтобы осторожно переместить червей со стенки трубки, а затем удалить плавающих червей в свежую трубку. Заполните трубку S-буфером для мытья червей и центрифугой при 1500 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 30 секунд.Снимите буфер и повторите стирку еще два раза. После третьего мытья, тщательно удалить supernatant, убедившись, что не удалить червей, и использовать 1000 микролитер пипетки отзыв для измерения влажного объема промывают червей. Для белковых осадков используйте пипетку Pasteur, чтобы добавить промытых червей к равному объему ледяной 10% трихлороакетической кислоты в гомогенизаторе, помещенном на лед.Гомогенизировать с помощью 40 штрихов passel с вращением, до 1300 об /мин. Используйте ультразвуковой гомогенизатор с 20%-долгу цикла sonicate гомогената. Используйте пипетку Pasteur для переноса гомогената в 1,5 миллилитровую трубку, помещенную на лед.После переноса гомогената в микро центрифугу трубки, центрифуга на 8000 времени G при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы прояснить его. Перенесите супернатант в свежую трубку и добавьте четыре хлорида толярного калия и инкубировать на льду в течение 20 минут, чтобы нейтрализовать его. Затем центрифуга его на 8000 раз G при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.Перенесите супернатант в свежую трубку и храните при 80 градусах цельсия до тех пор, пока это не будет необходимо для дальнейших анализов. Для измерения концентрации лактата используйте набор колоритных анализов для проведения дубликатов анализов для тестовых образцов. Добавьте 10 микролитров тестовых образцов к каждому колодец пластины из 96 колодец, а затем добавьте лактатный буфер анализа к каждому образцу, чтобы настроить громкость до 15 микролитров.Разбавить 100-миллиметровый стандарт L-Lactate с лактатным буфером анализа до одного миллимолара. Затем, в ряд скважин, добавьте ноль, два, четыре, шесть, восемь и 10 микролитров разбавленного стандарта L'Lactate. Добавьте 50 микролитров реакционной смеси к каждой хорошо, и инкубировать при комнатной температуре защищены от света, по крайней мере 30 минут для цвета развиваться.Наконец, используйте считыватель микропластиц для измерения абсорбтности каждой пластины на 570 нанометров. Вычесть абсорбт фонового контроля смеси из поглощения реакции смеси. Затем вы график лактат стандартной кривой, и вычислить концентрации лактата из кривой путем умножения каждой концентрации на 2,25.Используйте набор колоритетрического анализа для измерения концентрации пирувата в пробах испытаний и проведения дуплексных экспертиз. Добавьте 10 микролитров тестовых образцов в различные скважины пластины из 96 скважин и добавьте в каждый образец 90 микролитров работающего реагента. Инкубация покрывается в течение 30 минут при комнатной температуре.Затем поместите пластину в считыватель микропластиц для измерения абсорбции каждой пластины на 570 нанометров. Участок пируват стандартной кривой, и вычислить концентрации пирувата из стандартной кривой путем умножения каждой концентрации на 2,25. И, наконец, для измерения концентрации белка в тестовых образцах используйте набор колоритных анализов, как описано в текстовом протоколе.После белковых осадков, колоритные анализы могут быть использованы для количественного определения концентраций лактата и пирувата. Этот эксперимент показывает точность колоритных анализов, противоречащих предыдущим отчетам C.Elegans. Кроме того, эти анализы достаточно чувствительны для измерения концентраций лактата и пирувата даже в небольших пробах в течение короткого периода времени.Для точного обнаружения лактата и пирувата в C.elegans, очень важно выполнять белковые осадки во время гомогенизации червей. Количество обнаруженного лактата и пирувата выше, когда образцы являются белками, осаждаемыми во время гомогенизации, по сравнению с нетронутой цитозоловой фракцией или после гомогенизации, когда не было обнаружено лактата или пирувата вообще.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Ковалентного связывания антител с целлюлозой дисков бумаги и их применение в видимую невооруженным глазом колориметрические иммуноанализа

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Сопоставление метаболизма: Мониторинг активности лактатдегидрогеназы непосредственно в ткани

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Спектрофотометрические определение содержания Phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...