Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación especial de Daito Bunka University a Sumino Yanase.

1. sincronizada cultura de C. elegans
<ol><li>Antes de sembrar, la cultura la Escherichia coli (e. coli) tensión OP50 durante la noche a 37 ° C en 300 mL de medio líquido de caldo Luria-Bertani (LB). Tienda OP50 cultivadas a-4 ° C.<ol>
<li>Para hacer el medio líquido caldo LB, use 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 1,5 mL de NaOH N 1 y añadir a 1 L con agua desionizada. Autoclave. Nota: Las cepas OP50 y C. elegans están disponibles en el centro de...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

Al utilizar estos kits de ensayo colorimétricos, el paso más crítico en la extracción de la muestra para detectar celular lactato y piruvato exactamente en C. elegans es el proceso de precipitación de la proteína durante la homogeneización (figura 1). No es estrictamente necesario utilizar un homogeneizador de teflón, como otros homogeneizadores (e.g., Dounce y Rectificadoras de tejido, o molinos de grano) son también adecuados para la extracción en pequeña escal...

Concentraciones de lactato y piruvato son consideradas ampliamente como productos intermedios del metabolismo energético y están relacionados con los Estados de la glicolisis, ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y cadena de transporte de electrones en las células de organismos aerobios. Una serie de reacciones en la glicolisis se oxida glucosa a piruvato, que se encuentra en una encrucijada metabólica y puede convertir a los carbohidratos a través de la gluconeogénesis, a ácidos grasos y el metabolismo de la energía a través de acetil-CoA y al aminoácido alanina. El ciclo TCA se produce bajo la presencia de suficiente oxígeno disuelto y es fundamental para la conversión de glucosa a energía. Sobre todo, la alteración del metabolismo secundario es un fenómeno interesante en el que la glicolisis se utiliza predominante para la producción de energía y la respiración mitocondrial aeróbica, que implica la cadena de transporte de electrones y ciclo TCA, es regulada en el cáncer de mamífero células de1,2. Hemos demostrado recientemente que los niveles de lactato y la relación consiguiente lactato/piruvato (L/P) disminuyeron durante el envejecimiento en el organismo modelo Caenorhabditis elegans (C. elegans). Asimismo, encontramos que los mamíferos tumor supresor p53 ortholog CEP-1 en C. elegans tiene un papel importante en las alteraciones relacionadas con la edad del metabolismo energético mediante la activación de sus dianas transcripcionales3.
En ensayos biológicos, tales como la medición de las concentraciones de lactato y piruvato en las células, la sensibilidad, precisión, tamaño de la muestra y tiempo de incubación de kits de ensayo colorimétricos/fluorimétrico han mejorado dramáticamente. Debido a las innovaciones tecnológicas, que ahora son capaces de analizar diversos metabolitos y metabolitos intermedios sin el cultivo a gran escala de C. elegans, que es difícil dado su pequeño tamaño. En general, la sensibilidad de un ensayo colorimétrico es un orden de magnitud más pequeño que el de un ensayo fluorimétrico; sin embargo, el método colorimétrico es más conveniente en el entorno de los laboratorios comunes. Además, una técnica de extracción con precipitación de homogeneización y proteína es crucial para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato en las células de C. elegans porque este nematodo se encuentra dentro de un exoesqueleto llama la cutícula, a diferencia de las líneas de células de mamífero cultivadas4,5. Aquí, describimos un protocolo para analizar las concentraciones de lactato y piruvato usando kits de ensayo colorimétrico comercial incluyendo consejos para extracción de muestra de C. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Lactato y piruvato son intermediarios clave de vías metabólicas de energía intracelular. Monitoreo de la relación lactato/piruvato en las células ayuda a determinar si existe un desequilibrio en el metabolismo de la energía relacionada con la edad entre la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis aeróbica. A continuación, os mostramos la utilización de kits de ensayo colorimétricos comerciales para lactato y piruvato en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. Recientemente, la sensibilidad y la precisión de los kits de ensayo colorimétricos/fluorimétrico han mejorado grandemente por la investigación y desarrollo llevado a cabo por los fabricantes de reactivos. Los mejores reactivos han permitido el uso de ensayos en pequeña escala con una placa de 96 pocillos en C. elegans. En general, un ensayo fluorimétrico es superior en sensibilidad para un ensayo colorimétrico; sin embargo, el método colorimétrico es más conveniente para el uso en laboratorios comunes. Otra cuestión importante en estos ensayos para la determinación cuantitativa es la precipitación de la proteína de homogeneizado de C. elegans muestras. En nuestro método de precipitación de la proteína, precipitados comunes (por ej., ácido tricloroacético, ácido perclórico y ácido metafosfórico) se utilizan para la preparación de la muestra. Una muestra de ensayo libre de proteína es preparada agregando directamente Frío precipitado (concentración final de 5%) durante la homogeneización.

Usando el análisis colorimétricos para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato, demostró la exactitud de estos análisis en comparación con informes anteriores en la C. elegans7,8. Aquí, el proceso de precipitación de la proteína durante la extracción de la muestra fue el paso más crucial para generar valores precisos. Para la precipitación de la proteína, precipitados comune...

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Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Esta investigación puede ayudar a responder a cualquier pregunta en el campo del recuento de bioquímica y la metodología, como un análisis de los derechos de desarrollo en nematodos. La principal ventaja de esta técnica es la precipitación proteica en la extraducción y la bebida y homogeneización de los gusanos. Comience este experimento cultivando la cepa E.coli OP50 en 300 mililitros de caldo LB medio líquido a 37 grados Celsius durante la noche.Almacene el OP50 exitoso a cuatro grados centígrados. Pipetear dos mililitros del OP50 cultivado en un mínimo de tres NGM previamente preparados, o placas de agar de medios de crecimiento de nematodos y se extienden a mano girando la placa. Incubar las placas a temperatura ambiente durante la noche para crear una capa delgada de OP50.A continuación, utilice un palillo de dientes estéril para recoger un pedazo de agar de un plato con gusanos, para agregar al menos 100 gusanos a cada placa OP50 NGM. Cultivo de al menos tres placas con los gusanos a 20 grados Celsius, hasta que los gusanos alcanzan la etapa adulta, que se confirma bajo microscopio estereoscópico. Localice hermafroditas gravitacionales llenas de huevos con un microscopio estereoscópico.Después de añadir cinco mililitros de S-buffer a las placas, utilice la pipeta Pasteur para transferir los gusanos de las tres placas a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los gusanos tres veces añadiendo 15 mililitros de S-buffer y luego centrifugando a 300 veces G a temperatura ambiente durante 30 segundos. Si el volumen de S-buffer supera los cinco mililitros, elimine el búfer sobrante después de la centrifugación.Para una exonización exitosa y aislamiento de óvulos a granel, disolver los gusanos en 0,5 mililitros de solución de hipoclorato alcalino. Mezclar invirtiendo e incubar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Centrifugar a 1.400 RPM durante 30 segundos para extraer la solución.Utilice 15 mililitros de S-buffer para lavar el pellet de huevo. Después de centrifugarlo, retire el sobrenadante y repita este lavado al menos tres veces. Después del último lavado, suspendemos el pellet en cinco a seis mililitros de S-buffer, sin E.coli e incubamos los huevos durante la noche a 20 grados celsius para incubarlos y lograr el cultivo síncrono H de larvas de la etapa L1.Pipetear 10 microlitros de S-buffer que contienen gusanos L1 en tres resbalones de cubierta. Cuente las larvas bajo un microscopio estereoscópico y calcule el promedio para determinar el número aproximado de larvas de etapa L1. Finalmente, transfiera las larvas de etapa L1 a cinco placas de agar NGM con OP50 y creció a 20 grados centígrados hasta la etapa adulta joven, durante la cual se produce la autofertilización y se ponen unos pocos huevos.Observe los gusanos todos los días bajo el microscopio y luego recoja al joven adulto, o gusanos de cinco días de edad. Para seleccionar solo gusanos vivos, agregue los gusanos suspendidos en tres a cuatro mililitros de S-buffer a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue un volumen igual de 60% de sacarosa helada y mezcle.Centrifugar el tubo a 1.500 veces G a cuatro grados centígrados durante 15 segundos. A continuación, utilice una pipeta Pasteur para mover cuidadosamente los gusanos de la pared del tubo, y luego retire los gusanos flotantes en un tubo fresco. Llene el tubo con S-buffer para lavar los gusanos, y centrifugar a 1500 veces G a cuatro grados Celsius durante 30 segundos.Retire el tampón y repita el lavado dos veces más. Después del tercer lavado, retire cuidadosamente el sobrenadante, asegurándose de no quitar ningún gusano, y utilice una punta de pipeta de 1.000 microlitros para medir el volumen húmedo de los gusanos lavados. Para la precipitación de proteínas, utilice una pipeta Pasteur para añadir los gusanos lavados a un volumen igual de ácido tricloroacético frío en frío 10% en un homogeneizador colocado en hielo.Homogeneizar usando 40 golpes de passel con rotación, hasta 1, 300 RPM. Utilice un homogeneizador ultrasónico con un ciclo de trabajo del 20% para sonicar el homogeneizar. Utilice una pipeta Pasteur para transferir el homogeneato a un tubo de 1,5 mililitros colocado sobre hielo.Después de transferir el homogeneizar a un tubo de micro centrífuga, centrifugar a 8.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para aclararlo. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y agregue cuatro cloruros de potasio molar e incubar sobre hielo durante 20 minutos para neutralizarlo. Luego centrífla a 8.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y guárdelo a 80 grados Celsius hasta que sea necesario para ensayos posteriores. Para medir la concentración de lactato, utilice un kit de ensayo colorimétrico para realizar análisis duplicados para las muestras de prueba. Agregue 10 microlitros de las muestras de prueba a cada pozo de una placa de 96 pozos y, a continuación, agregue el búfer de ensayo de lactato a cada muestra para ajustar el volumen a 15 microlitros.Diluir 100 mililitros de L+Lactato Estándar con tampón de ensayo de lactato a un milimolar. Luego, en una serie de pozos, agregue cero, dos, cuatro, seis, ocho y 10 microlitros de L+Lactato Standard diluido. Añadir 50 microlitros de mezcla de reacción a cada pozo, e incubar a temperatura ambiente protegida de la luz durante al menos 30 minutos para que el color se desarrolle.Por último, utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia de cada pozo a 570 nanómetros. Restar la absorbancia de la mezcla de control de fondo de la absorbancia de la mezcla de reacción. A continuación, trazar la curva estándar de lactato, y calcular las concentraciones de lactato de la curva multiplicando cada concentración por 2,25.Utilice un kit de ensayo colorimétrico para medir la concentración de piruvato en las muestras de ensayo y realizar exámenes dúplex. Agregue 10 microlitros de las muestras de prueba a diferentes pozos de una placa de 96 pozos y agregue 90 microlitros de reactivo de trabajo a cada muestra. Incubar cubierto durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, coloque la placa en el lector de microplacas para medir la absorbencia de cada pozo a 570 nanómetros. Trazar la curva estándar del piruvato y calcular las concentraciones de piruvato a partir de la curva estándar multiplicando cada concentración por 2,25. Y por último, para medir la concentración de proteínas en las muestras de ensayo, utilice un kit de ensayo colorimétrico como se describe en el protocolo de texto.Después de la precipitación proteica, los ensayos colorimétricos se pueden utilizar para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato. Este experimento muestra la precisión de los ensayos colorimétricos contrarios a los informes anteriores en C.Elegans. Además, estos ensayos son lo suficientemente sensibles para medir las concentraciones de lactato y piruvato, incluso en muestras a pequeña escala en un corto período de tiempo.Para detectar con precisión el lactato y el piruvato en C.elegans, es crucial realizar precipitación proteica durante la homogeneización de los gusanos. La cantidad de lactato y piruvato detectados es mayor cuando las muestras se precipitan a proteínas durante la homogeneización, en comparación con la fracción citosólica intacta o después de la homogeneización cuando no se detectó lactato o piruvato en absoluto.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Covalente La unión de anticuerpos a los discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en-simple vista colorimétricos inmunoensayos

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Investigación

Bioquímica

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

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Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

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Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis

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