Name: small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Detta arbete stöddes ekonomiskt av en särskild forskningsanslag från Daito Bunka universitet till Sumino Yanase.

1. synkroniserade kultur av C. elegans
<ol><li>Innan sådd Sila kultur den Escherichia coli (E. coli) OP50 över natten vid 37 ° C i 300 mL Luria-Bertani (LB) buljong flytande medium. Lagra den odlade OP50 vid-4 ° C.<ol>
<li>Att göra LB buljong flytande medium, använda 10 g trypton, 5 g av jästextrakt, 10 g NaCl och 1,5 mL 1 N NaOH och Lägg till 1 L med avjoniserat vatten. Autoklav. Obs: Stammar OP50 och C. elegans är tillgängliga från stadens Caenorhabditis genetik (Univ...

<ol>
	<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+mitochondrial+respiration.">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li><li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+p53/CEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans.">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li><li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuticle.">The cuticle.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).</li><li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans.">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants.">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li><li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate:+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant.">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li><li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan.">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li></ol>

När utnyttja dessa kolorimetriska assay kit, är det mest kritiska steget i provet utvinning att upptäcka cellulära laktat och pyruvat korrekt i C. elegans en process av protein nederbörd under homogenisering (figur 1). Det är inte absolut nödvändigt att använda en Teflon Homogenisatorer, som andra Homogenisatorer (t.ex., Dounce och avsmalnande vävnad slipmaskiner eller pärla mills) är också lämpade för småskalig utvinning av maskar. Vi upptäcka inte cellul?...

Laktat och pyruvat koncentrationer betraktas allmänt som intermediärer av energimetabolism, och är besläktade med påstår av glykolys, tricarboxylic syra (TCA) cykel och elektron transportkedjan i cellerna av aeroba organismer. En serie reaktioner i glykolys oxiderar glukos till Pyruvat, som ligger vid skiljevägen metabola och kan omvandlas till kolhydrater genom glukoneogenes, fettsyror och energiomsättning via acetyl-CoA och till den aminosyran alanin. TCA cykeln inträffar under närvaro av tillräckligt löst syre och är grundläggande för omvandlingen av glukos till energi. Särskilt, förändring av sekundär metabolism är ett intressant fenomen där glykolys används huvudsakligen för produktion av energi och aerob mitokondriell andning, som innebär den TCA cykeln och elektron transportkedjan, är nedreglerade i däggdjur cancer celler1,2. Vi visade nyligen att laktat nivåer och åtföljande laktat/pyruvat (L/P) förhållandet minskat under åldrandet i modell organismen Caenorhabditis elegans (C. elegans). Jämväl, Vi hittade att det däggdjur tumör suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en viktig roll i de åldersrelaterade förändringarna av energimetabolism genom aktivering av dess transkriptionell mål3.
I biologiska analyser, såsom mätning av laktat och pyruvat i celler, har den känslighet, noggrannhet, urvalsstorlek och inkubationstid av kolorimetriska/fluorimetriskt assay kit förbättrats dramatiskt. På grund av tekniska innovationer är vi nu kunna analysera olika metaboliter och mellanliggande metaboliter utan storskaliga kulturen i C. elegans, vilket är svårt med tanke på dess ringa storlek. Känsligheten hos en kolorimetrisk test är i allmänhet en storleksordning som är mindre än en fluorimetriskt analys; den kolorimetriska metoden är dock mer passande i fastställandet av gemensamma laboratorier. Dessutom är en utvinning teknik som innehåller homogenisering och protein fällning avgörande för kvantitativ bestämning av laktat och pyruvat koncentrationer i C. elegans celler eftersom denna nematod är inbakad i ett exoskelett kallas nagelband, till skillnad från odlade däggdjursceller linjerna4,5. Här beskriver vi ett protokoll för att analysera laktat och pyruvat koncentrationer med kommersiella kolorimetrisk test kit inklusive tips för provet extraktion från C. elegans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:696px;" width="696">
	<tbody>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&#160;</td>
			<td style="width:100px;">BioVision</td>
			<td style="width:136px;">#K607-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/fluorimetric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">EnzyChrom Pyruvate 
			Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">BioAssay 
			Systems</td>
			<td style="width:136px;">#EPYR-100</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric/ fluorometric 
			100 assays; Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:247px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">#23225</td>
			<td style="width:213px;">colorimetric assay; store at 
			&#160;room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Trichloroacetic Acid</td>
			<td style="width:100px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:136px;">#207-04955</td>
			<td>store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:247px;">Teflon homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Iwaki/Pyrex</td>
			<td style="width:136px;">#358034 (Wheaton)</td>
			<td style="width:213px;">Instead of Iwaki/Pyrex, 
			available by Wheaton</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale colorimetric assays of intracellular lactate and pyruvate in the nematode caenorhabditis elegans

Laktat och pyruvat är viktiga intermediärer av intracellulära energi metaboliska vägar. Övervakning laktat/pyruvat förhållandet i celler hjälper till att avgöra om det finns en obalans i åldersrelaterad energimetabolism mellan mitokondriell oxidativ fosforylering och aerob glykolys. Här visar vi utnyttjande av kommersiella kolorimetrisk test kit för laktat och pyruvat i modell organismen C. elegans. Nyligen, känslighet och noggrannhet av de kolorimetriska/fluorimetriskt assay Kit har förbättrats avsevärt genom forskning och utveckling som genomförs av Reagenstillverkare. Förbättrad reagenserna har aktiverat användningen av småskaliga försök med en plattan med 96 brunnar i C. elegans. I allmänhet är en fluorimetriskt analys överlägsen känslighet en kolorimetrisk test; men är den kolorimetriska metoden mer lämplig för användning i vanliga laboratorier. En annan viktig fråga i dessa analyser för kvantitativ bestämning är protein utfällning av homogeniserad C. elegans prover. I vår protein nederbörd metod, gemensamma precipitants (t.ex., triklorättiksyra, perklorsyra och metaphosphoric syra) används för provberedning. Ett protein-fria assay prov förbereds genom att direkt lägga kallt fällningsmedel (slutliga koncentration av 5%) under homogenisering.

Använda de kolorimetriska analyserna för kvantitativ bestämning av laktat och pyruvat koncentrationer, visade vi riktigheten av dessa analyser jämfört med tidigare rapporter i C. elegans7,8. Här var processen av protein nederbörd under prov extraktionen det mest avgörande steget att generera korrekta värden. För protein fällning, gemensamma precipitants (t.ex., TCA, PCA, eller metaphosphoric syra) kan ...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Vi beskriver en modifierad småskalig utvinning och kolorimetriska analyser av laktat och pyruvat i Nematoden C. elegans. När utnyttja kommersiella assay kit, är den tekniska utvecklingen av sin känslighet och noggrannhet viktigt. Protein nederbörd i utvinning är det mest kritiska steget för kvantitativ bestämning av intracellulära metaboliter.

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Denna forskning kan hjälpa till att besvara eventuella frågor i dem biokemi räkning och metodik fält såsom en analys av utvecklingsrättigheter i nematoden. Den största fördelen med denna teknik är proteinnedfällning i extraduktion och dryck och homogenisering av maskarna. Starta detta experiment genom att odla E.coli OP50 stam i 300 milliliter lb buljong flytande medium vid 37 grader Celsius över natten.Lagra framgångsrika OP50 vid fyra grader Celsius. Pipett två milliliter av den odlade OP50 på minst tre tidigare beredda NGM, eller Nematode Growth Media Agar Plattor och sprids för hand virvlande plattan. Inkubera plattorna i rumstemperatur över natten för att skapa ett tunt lager av OP50.Därefter använder en steril tandpetare för att plocka en bit av agar från en platta med maskar, för att lägga till minst 100 maskar till varje OP50 NGM-platta. Odla minst tre plattor med maskarna vid 20 grader Celsius, tills maskarna når vuxenstadiet, vilket bekräftas under stereoskopiskt mikroskop. Lokalisera gravid hermafroditer fyllda med ägg med hjälp av en stereoskopisk mikroskop.Efter att ha lagt till fem milliliter S-buffert till plattor, använd Pasteur pipetter för att överföra maskarna från alla tre plattorna till en 15 milliliter koniska röret. Tvätta maskarna tre gånger genom att tillsätta 15 milliliter S-buffert och sedan centrifugera vid 300 gånger G i rumstemperatur i 30 sekunder. Om volymen av S-buffert överstiger fem milliliter, avlägsna överskottsbufferten efter centrifugering.För framgångsrik exonisering och bulk äggisolering, lös maskarna i 0,5 milliliter av alkalisk hypokloratlösning. Blanda genom att invertera och inkubera i rumstemperatur i 10 till 15 minuter. Centrifugera vid 1, 400 RPM i 30 sekunder för att ta bort lösningen.Använd 15 milliliter S-buffert för att tvätta äggpelleten. Efter centrifugering det ta bort supernatanten och upprepa denna tvätt minst tre gånger. Efter den sista tvätten, vi avbryta pelleten i fem till sex milliliter av S-buffert, utan E.coli och ruva äggen över natten vid 20 grader Celsius för att kläcka dem och uppnå H synkron kultur av L1 steg larver.Pipett 10 mikroliter av S-buffert innehållande L1-maskar på tre täckslirningar. Räkna larverna under ett stereoskopiskt mikroskop och beräkna medelvärdet för att bestämma det ungefärliga antalet L1-steglarver. Slutligen, överför L1-steg larverna till fem NGM Agar Plates med OP50 och odla dem i 20 grader Celsius tills den unga vuxna etappen, under vilken självbefruktning sker och några ägg läggs.Observera maskarna varje dag under mikroskopet och samla sedan de unga vuxna, eller fem dagar gamla maskar. Om du bara vill välja levande maskar lägger du till maskarna upphängda i tre till fyra milliliter S-buffert till ett koniskt rör på 15 milliliter. Lägg sedan till en lika stor volym iskall 60%sackaros och blanda.Centrifugera röret vid 1, 500 gånger G vid fyra grader Celsius i 15 sekunder. Använd sedan en Pasteur-pipett för att försiktigt flytta maskarna från väggen på röret, och ta sedan bort de flytande maskarna i ett nytt rör. Fyll röret med S-buffert för att tvätta maskarna, och centrifug vid 1500 gånger G vid fyra grader Celsius i 30 sekunder.Ta bort bufferten och upprepa tvätten två gånger till. Efter den tredje tvätten, ta försiktigt bort supernatanten, se till att inte ta bort några maskar, och använd en 1, 000 microliter pipettspets för att mäta den våta volymen av de tvättade maskarna. För proteinnederbörd, använd en Pasteurpipett för att lägga till de tvättade maskarna till en lika stor volym av iskall 10%-triklorättiksyra i en homogenis som placeras på is.Homogenisera med hjälp av 40 slag av passel med rotation, upp till 1, 300 RPM. Använd en ultraljud homogenisator med 20%plikt cykel att sonikera homogenate. Använd en Pasteur-pipetter för att överföra homogenatet till 1,5 milliliterrör som placeras på is.Efter överföring av homogenatet till en mikro centrifugrör, centrifug vid 8, 000 tid G vid fyra grader Celsius i 10 minuter för att klargöra det. Överför supernatanten till ett nytt rör och tillsätt fyra molar kaliumklorid och inkubera på is i 20 minuter för att neutralisera den. Sedan centrifugera den vid 8, 000 gånger G vid fyra grader Celsius i 10 minuter.Överför supernatanten till ett nytt rör och förvara vid 80 grader Celsius tills det behövs för ytterligare analyser. För att mäta koncentrationen av laktat, använd en kolorimetrisk analyssats för att utföra dubbletter av analyser för proverna. Tillsätt 10 mikroliter av testproverna till varje brunn av en 96-brunnsplatta och tillsätt sedan laktatanalysbuffert till varje prov för att justera volymen till 15 mikroliter.Späd 100 millimolar L+Laktat Standard med laktatanalysbuffert till en millimolar. Sedan, i en serie brunnar, tillsätt noll, två, fyra, sex, åtta och 10 mikroliter av utspädd L + Lactate Standard. Tillsätt 50 mikroliter reaktionsmix till varje brunn, och inkubera vid rumstemperatur skyddad från ljus i minst 30 minuter för att färgen ska utvecklas.Slutligen, använd en mikroplattläsare för att mäta absorbansen av varje brunn vid 570 nanometer. Subtrahera absorbansen av bakgrundskontrollmixen från reaktionsmixens absorbans. Rita sedan laktatstandardkurvan, och beräkna laktathalterna från kurvan genom att multiplicera varje koncentration med 2,25.Använd en kolorimetrisk analyssats för att mäta koncentrationen av pyruvat i testproverna, och utföra duplexundersökningar. Tillsätt 10 mikroliter av testproverna till olika brunnar av en 96-brunnsplatta, och tillsätt 90 mikroliter arbetsreagens till varje prov. Inkubera täckt i 30 minuter i rumstemperatur.Placera sedan plattan i mikroplattläsaren för att mäta uppbådigheten hos varje brunn vid 570 nanometer. Rita pyruvat standardkurvan, och beräkna pyruvat koncentrationerna från standardkurvan genom att multiplicera varje koncentration med 2,25. Och slutligen, för att mäta proteinkoncentrationen i testproven, använd en kolorimetrisk analyssats enligt beskrivningen i textprotokollet.Efter proteinutfällning kan koloriska analyser användas för kvantitativ bestämning av laktat- och pyruvatkoncentrationer. Detta experiment visar noggrannheten i koloromiska analyser i motsats till tidigare rapporter i C.elegans. Vidare är dessa analyser tillräckligt känsliga för att mäta laktat- och pyruvatkoncentrationer även i småskaliga prover på kort tid.För att exakt upptäcka laktat och pyruvat i C.elegans är det avgörande att utföra proteinutfällning vid homogenisering av maskarna. Mängden laktat och pyruvat som detekteras är högre när proverna är proteinutfällda under homogenisering, jämfört med intakt cytosolisk fraktion eller efter homogenisering när det inte fanns något laktat eller pyruvat som detekterats alls.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Kovalent bindning av antikroppar till cellulosapapper skivor och deras tillämpningar inom blotta ögat Kolorimetriska Immun

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kartläggning Metabolism: Övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet direkt i vävnad

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Tallrik-baserade storskalig odling av Caenorhabditis elegans: provberedning för studie av metabola förändringar i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination och Deubiquitination assays av Nukleosomala Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...