Name: manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

המחברים תודה שו השימוטו, Aoi יושידה, של והטה טאאקו באוניברסיטת Doshisha על תרומתם הנדיבה עם הגדרת ניסיוני. עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI (15H. 02121, 15 05400 K, 25103012, 50587441) על ידי התוכנית MEXT-Supported עבור קרן מחקר אסטרטגי באוניברסיטאות הפרטי. מחקר זה גם נתמך על ידי מענק הפולני של קונסורציום מדעי ידע (מוביל מרכז המחקר הלאומי) "חיה – בטוח אוכל בריא", החלטה של משרד המדע, השכלה גבוהה מס 05-1/KNOW2/2015.

1. הכנת תאים
<ol><li>לשמור על NAMRU (תאי NMuMG) בתאי אפיתל עטין עכבר עם 5 מ של D-מ המכיל 10% (v) העובר שור סרום (FBS) ו- 1% (v) פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) בבקבוקון3 25 ס מ. של הסרה Dulbecco שונה בינונית של הנשר (D-מ), המכיל 10% FBS ו 1% P/S.</li>
	<li>להוסיף 3-5 מ ל תמיסת 37 ° C באגירה פוספט (PBS) (-) הבקבוקון. שימו לב כי ה-pH של PBS 7.1-7.3.</li>
	<li>הסר כל טוב, מגניב. הבקבוק באמצעות של העצמות.</li>
	<li>להוסיף 1.5 מ של 37 ° C טריפסין (0.25%, w/v) הבקבוקון.</li>
	<li>תקופת דגירה את הבקבוקון של 1-2 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO.</li>
	<li>להוסיף מ 3.5 ל D-מ המכיל 10% FBS ו 1% P/S הבקבוקון. פיפטה לערבב.</li>
	<li>להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, centrifuge זה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שימו לב כי רדיוס הסיבוב ומהירות הסיבוב לצנטריפוגה ס"מ 16.6 ו 1500 סל ד, בהתאמה. תחת תנאי זה, הדיסקה היחסי הוא 417 x g.</li>
	<li>הוסף 5 מ ל D טריים-מ (10% FBS ו 1% P/S) הבקבוקון לאחר כ רפה בעברית המדיום (אם יש צורך, cryopreserve תאי הקפאה קריוגנית פתרון, בעקבות הוראות היצרן).</li>
</ol>2. הכנת לתוספי (דקס)
<ol><li>הכן 80 מ"ג/מ"ל של דקס פתרון על ידי ערבוב 10 מ"ל של D-מ (10% FBS, 1%P/S) ו- 0.8 גר' דקס. שימו לב כי ניתן לסנן את הפתרון דקס עם מסנן מזרק (0.22 מיקרומטר) לאחר התאים יש תרבותי למשך זמן מספיק.</li>
	<li>להכין השעיה התא המכיל 40 מ"ג/מ"ל דקס בינוני על ידי ערבוב µL 200 בפתרון דקס, 200 µL של התליה תא המבושלות 2.1. שימו לב כי צפיפות מספר של תאים בהפתרון הינו כ 2.3 × 105 תאים למ"ל.</li>
</ol>3. הכנה לייזר ומיקרוסקופיה
<ol><li>להפעיל את הלייזר (גל רציף, 1,064 באורך גל של nm) (איור 1). שימו לב כי השימוש של קרן לייזר עם אורך גל אדום-סגול אזור הינו היעיל ביותר; אזור באורך גל זה נקרא חלון האבחון והטיפול10 מאז זה נספג מינימלית על ידי התאים.</li>
	<li>לחץ פעמיים על סמל התוכנה.</li>
	<li>לחץ פעמיים על שהסמלים עבור המצלמה ①, ② דיודות פולטות אור (LED), מיקוד ③ להתאים ולאחר ④ עובר שלב. מציג המתאים ①-④ יופיע (איור 1b).</li>
</ol>4. תא מניפולציה באמצעות מערכת לייזר השמנה
<ol><li>מקום 20 µL של המדגם מוכן בשלב 2.2 על הזכוכית המכסה התחתון (0.17 מ מ עובי, גודל = 30 מ"מ × 40 מ"מ), ומכסים אותו עם הזכוכית המכסה העליון (0.17 מ מ עובי, גודל = 18 מ מ × 18 מ מ), עם הפרדה שסופקו על-ידי שני מפרידי (0.17 מ מ עובי גודל = 10 מ"מ × 24 מ"מ), כמוצג באיור2. שימו לב כי המשקפיים האלה אינם מחייבים ציפוי מיוחד.</li>
	<li>במקום התא מדגם מוכן בשלב 4.1 העדשה המטרה נמוכה (מים טבילה עם ca. 10 μl, הגדלה = 60 X, ומרחק עבודה = 0.28 מ מ, מפתח נומרי = 1.2)).</li>
	<li>לצרף את העדשה המטרה העליונה (מים טבילה עם ca. 10 μl, הגדלה = 60 X, ומרחק עבודה = 2 מ מ, מפתח נומרי = 1.0) בחלק העליון של התא הדגימה.</li>
	<li>הפעל את ה-LED אור על-ידי לחיצה על הסמל 2 (איור 1b).</li>
	<li>להתאים את המרחק בין המדגם העדשה המטרה נמוכה יותר על-ידי לחיצה על הסמלים בלוח 3 (איור 1b) עד שיהיה בפוקוס.</li>
	<li>להאיר את קרני לייזר עמדה 1 ו- 2 עמדה (איור 1B) של המדגם על ידי לחיצה על סמלים אני II, III (איור 1b).</li>
	<li>להגדיר את עוצמת הלייזר כל 1,500 מגה-וואט על-ידי הזנת ערך זה על הסמל הרביעי (איור 1b).</li>
	<li>. מהלך הבמה לדוגמה על-ידי לחיצה על סמל 4 כיוונים אנלוגיים (איור 1b) עד תא נלכד-עמדה 1 (איור 1b).</li>
	<li>גרור הסמן המציין מיקום 2 (איור 1b) עד תא אחר הוא לכוד-מיקום 2.</li>
</ol>5. בניית מבנה תלת-ממדי (3D) תא
<ol><li>לטפל תא יחיד כך שיהיה בקשר עם תא אחר. לשמור על מצב זה 300 s; קרי, כל תא הוא נחשף לייזר עבור 300 s.</li>
	<li>להקליט את ציר X-Y שמוצג באיור 1ב'.</li>
	<li>לבנות הרכבה תא 2D שרירותי על-ידי לכידה והעברה תא אחר לתאים.</li>
	<li>לבנות אסיפה סלולרית תלת-ממד על-ידי הזזת השלב למעלה ולמטה.</li>
	<li>לאשר כי מכלול נשאר יציב, אחרי הלייזר כבוי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold:+an+in+vitro+study.">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers.">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577 (2015).</li><li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel.">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li><li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation.">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li><li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells.">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li><li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+heterotypic+spheroid+model+for+studying+extracellular+vesicle-mediated+tumor+and+immune+cell+communication.">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+living+cells+to+construct+a+3D+single-cell+assembly+without+an+artificial+scaffold.">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319 (2017).</li><li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photothermolysis:+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation.">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li><li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Stable+Cell-Cell+Contact+without+a+Solid/Gel+Scaffold:+Non-invasive+Manipulation+by+Laser+under+Depletion+Interaction+with+a+Polymer.">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li><li>Rauch, P., J&#228;hnke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Tweezers+for+Quantitative+Force+Measurements+and+Live+Cell+Experiments.">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li><li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilt+control+in+optical+tweezers.">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המחקר הנוכחי מראה יישום בטון שלנו9,האחרונות דוחות11 על השימוש של פולימרים מסיסים לבנייה של הרכבות בתא יחיד תלת-ממד. הרכבות כזה stably נוצרים הפתרון בכמות גדולה כאשר הוא עד 10 מספר התאים, יכולים להיות מוחזקים על ידי קרן לייזר בודד. הרכבות לזרז על משטח זכוכית, כאשר ישנם יותר מ- 10 תאים. למרות הניסויים הם עדיין בשלב הפרימיטיבי, אנו מצפים כי המתודולוגיה רומן יכול להיות כלי רב עוצמה עבור הבנייה של מכלולים תא בודד 3D הדור הבא, אשר הכרחית להתקדמות בתחומים של ביולוגיה של התא, רפואה רגנרטיבית.
בפתרון המכיל פולימר לא, תאים להדוף את אחד את השני בשל אלקטרוסטטית חדירה והדיפ ה הנובעים משטח הטעינה, הכוח סלידה הידרציה, אפקט דחיה glycocalyx ו גליות ממברנה. שלנו מחקר קודם הראה כי זוגות התא יכול להיות יציבה במשך זמן רב כאשר התאים מטופלים עם פג. וחשוב מכך, התעבורה מוצלחת של זוג תא לאזור ללא פג, לאחר התאים הוחזקו במתקן קשר למשך 5 דקות בפג, עולה כי נשמר קשר סלולרי בצורה יציבה. זה טוב מוסבר במונחים של השפעה דלדול11, ומחילה בעצם באותו המנגנון ההרכבות הסלולר שנוצר באמצעות דקס9. התוצאות הנוכחיות שלנו מראים כי סוגים אחרים של מקרומולקולות טבעי גם יכול לשמש כדי לבנות יציב הרכבות סלולרית תלת-ממד.
למשלוח מהיר של תאים, חשוב הריכוז של פולימר. באופן כללי, צמיגות של הפתרון מגדילה באופן דרסטי הפולימר הוא נמס מעל הריכוז חפיפה. בתנאים האלה, קשה לתמרן תאים באמצעות מלקחיים אופטיים. לפיכך, הניסוי צריכה להתבצע מתחת הריכוז חפיפה. פתרון דקס, ריכוז חפיפה היא ca. 50 מ"ג/מ"ל (צמיגות קינטי הוא 5.5 מ מ2/s). כפי שמוצג הפניה למעורר 9, אסיפה הסלולר יציב נצפתה כאשר הריכוז של דקס היה 10 מ"ג/מ"ל עד 40 מ"ג/מ"ל. תוצאה זו עולה כי השפעת המחסור הוא גדול מספיק לשמור על קשר יציב תאים תאים גם כאשר הריכוז דקס הוא נמוך יותר מאשר הריכוז חפיפה. הוכח, כי התוספת של דקס אינה משפיעה על יכולת הקיום של התא עד 40 מ"ג/מ"ל 9.
הקמת שיטה לבנייה של הרכבות סלולרית תלת-ממד חשוב בתחום של רפואה רגנרטיבית, מאז מחקה של ויוו microenvironment תאית על ידי מבנה תאים בודדים יכולים להקל רקמת תאי גזע-derived צורה. עד כה השתמשנו בפרוטוקול הנוכחי כדי לבנות הרכבות הסלולר באמצעות תאים Neuro2A9 בנוסף NMuMG תאים. אנו מקווים ליצור מתודולוגיה ניסיוני עבור בניית 3D הסלולר מכלולים של מספר גדול יותר של תאים של מורפולוגיות שונות. מלקחיים אופטיים המערכת שפותחה על ידי. Ichikawa et al. 13 יהיה רלוונטי למטרה זו מאז הכיוון של התאים ניתנים לשליטה. ניסויים נוספים לאורך שורות אלה צריך להיות מבטיח.

בעוד ברקמות אנושיות מורכבים מספר מכלולים של תאים שיכולים לסייע לך לשמור על הומאוסטזיס של הגוף, תאים בודדים בכוחות עצמם גם לשחק תפקידים חשובים באמצעות אינטראקציה לתא. לכן, חשוב להבהיר כיצד תאים בודדים יכול להיות מגורה על ידי אותות חיצוניים וכיצד הם להעביר אותות כאלה אחרים תאים חסיד. למטרה זו, הוקמו מספר שיטות להקמת מבוססת על תא בודד את תלת-ממדי הרכבות (3D)1,2,3,4,5,6 7, ,8. עם זאת, החומרים בהם נעשה שימוש כדי לבנות הרכבות הסלולר עדיין ניתן לשפר. לדוגמה, ג'לים סינתטי, פולימרים כולל פוליאתילן גליקול (PEG) בעלי מאפיינים physicochemical כימיים מסוימים, עלולה להשפיע על התאים היעד (למשל, רעילות).
לאחרונה דיווחנו מערכת הרומן שיכול ליצור אסיפה 3D מבוססת על תא בודד של תאים באמצעות לתוספי (דקס) על-ידי יצירת קשר יציב תא תא9. אנחנו נחשבים כי טכנולוגיה זו יכול להיות שימושי במספר שדות מחקר, כולל רפואה רגנרטיבית ו אפילו וביולוגיה של סרטן. בדו ח זה, אנו מתארים איך לתפעל תאים בודדים ולבנות תלת-ממדי (3D) הרכבות הסלולר בנוכחות שונים הידרופילית ובמקרו-מולקולות ביולוגיות לרבות דקס לגרדום מלאכותי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Microscope IX71</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX71</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dextran(200,000; molecular biology-grade)</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">CAS.NO&#160; 9004-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Laser Trapping System (NanoTracker 2)</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">S/N T-05-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Upper Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">LUMPLFLN60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lower Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">UPLSAPO60XW</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Top Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C022401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Intermediate Cover Glass (Spacer)</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>custom-made (size = 10mm&#215;10mm, thickness = 0.17mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Bottom Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C030401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Camera</td>
			<td style="width:124px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:136px;">DFK 31AF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Software</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">NanoTracker2 PFM software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NMuMG cells&#160;</td>
			<td style="width:124px;">RIKEN BRC</td>
			<td style="width:136px;">RCB2868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PBS</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Cell banker</td>
			<td style="width:124px;">Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td style="width:136px;">ZR621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">D-MEM</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:279px;">FBS</td>
			<td style="width:124px;">Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td>
			<td style="width:136px;">172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">161-23181</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold

רפואה רגנרטיבית ו הנדסת רקמות מציעים מספר יתרונות לטיפול של מחלות עיקשות, מספר מחקרים הראו את החשיבות של תלת-ממדי (3D) הרכבות הסלולר בתחומים אלה. פיגומים מלאכותי שימשו לעיתים קרובות כדי לבנות הרכבות סלולרית תלת-ממד. אולם, פיגומים נהגו לבנות הרכבות הסלולר לפעמים רעילים, עשויים לשנות את המאפיינים של התאים. לכן, זה יהיה מועיל להקים שיטה רעיל להקלה על קשר תא-תא. במאמר זה, נסקור שיטה לבניית הרכבות הסלולר יציבה באמצעות מלקחיים אופטיים עם לתוספי. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי היא מקימה קשר יציב-לתא בתוך דקות ספורות. שיטה חדשה מאפשרת הבנייה של הרכבות הסלולר 3D פולימר הידרופילית טבעי, צפוי להיות שימושי עבור בניית הדור הבא הרכבות תא בודד 3D בתחומים של רפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות.

איור 1 מציג את המיקרוסקופ והתוכנה השתמשו במחקר זה. איור 2 היא ייצוג סכמטי של ההליך עבור הצבת הפתרון מדגם המכיל תאים. איור 3 מדגים היווצרות של מבנה פירמידה באמצעות מלקחיים אופטיים כפול-קרן. אם הניסוי יצליח, מהרכבות הסלולר אלה נשארים בעינם גם לאחר הלייזר כבוי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> איור 1 : (א) מערכת הבקרה עבור מערכת לייזר השמנה (NanoTracker2 (11)). המערכת מופעלת על-ידי הפעלת המתג לייזר ביצוע השלבים ①-③. (b) התוכנה לשליטה במערכת השמנה לייזר. המצלמה, הוביל אור, מיקוד להתאים ולאחר הזזת הבמה מופעלים על ידי לחיצה על סמלים ①, ②, ③ ו ④, בהתאמה. התמונה המיקרוסקופית מוצגת בלוח 1. הפקד/ביטול עבור ה-LED הוא בלוח 2. המוקד נשלטת בלוח 3. קרני לייזר הן מוקרן על עמדות 1 ו- 2 על ידי לחיצה על סמלים את הרביעי. הפרטים של Systemare השמנה זה לייזר מסופקים הפניה למעורר (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> איור 2: נציג מפרטים טכניים עבור הצבת הזכוכית שקופיות. µL 20 המדגם (השעיה התא המכיל לתוספי) הוא הניח בשקופית ולא להשתמש בו עבור לייזר מניפולציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> איור 3 :) מכלולים של תאי אפיתל (NMuMG) של צורת המיועדים ב מדיום עם דקס (40 מ"ג/מ"ל): פירמידה מוצג בתור דוגמה של אשכול תלת-ממד. b) איור סכמטי בצורת פירמידה תלת-ממדי הסלולר ההרכבה מוצג גם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

נדגים שיטה לבניית אסיפה מבוססת על תא בודד (3D) תלת-ממדי ללא לגרדום מלאכותי.

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

מתודולוגיה חדשנית זו מאפשרת לנו לבנות מכלילים תלת מימדיים, המותאמים לתאים בודדים רצויים, בתת פתרון חיץ מים המכיל פולימר הידרופילי לא ספציפי, על ידי יצירת מגע יציב בין תאים לתאים. בסרטון זה, נדגים כיצד אנו מתפעלים תאים בודדים רצויים ובונים הרכבות תאיות תלת-מימדיות ללא פיגום מלאכותי. כאן נראה את ההליך הניסיוני במדיום שלנו עם Dextran כדוגמה.כדי להתחיל, לשמור על תאים אפיתל בלוטת החלב עכבר NAMRU עם חמישה מיליליטר של DMEM, המכיל 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין, בבקבוק 25 ס"מ מעוקב במשך יומיים עד שלושה ימים. כאשר מוכן להמשיך, להשתמש שאפתן כדי להסיר את DMEM בתוספת ולהוסיף שלושה עד חמישה מיליליטר של PBS, כי הוא מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לשטוף את התאים. באמצעות שאפה, להסיר את כל PBS מן הבקבוק.מוסיפים 1.5 מיליליטר של טריפסין שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. אינקובט באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 1-2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 3.5 מיליליטר של DMEM המכיל 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין.פיפטה למעלה ולמטה לערבב. מעבירים את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר צנטריפוגה אותו ב 417 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאף את המדיום.הוסיפו חמישה מילימטרים של DMEM טרי המכיל 10%FBS ו-1%פניצילין-סטרפטומיצין. ואם נדרש, השתמש בפתרון cryopreservation כדי cryopreserve התאים כפי שמתואר על ידי הוראות היצרן. הראשון לערבב 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין עם 0.8 גרם של Dextran, כדי להכין 80 מיליגרם לכל פתרון מיליליטר דקסטרן.לערבב 200 microliters של פתרון Dextran זה עם 200 microliters של השעיית התא שהוכן בעבר, כדי ליצור השעיה התא המכיל 40 מיליגרם למיליליטר דקסטרן מדיום. כדי להתחיל, להפעיל לייזר, שים לב כי השימוש בקרן לייזר עם אורך גל באזור אדום כמעט אינפרא אדום הוא היעיל ביותר. הבא לפתוח את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.לחץ פעמיים על סמל המצלמה ושים לב שהצג המתאים יצץ. לאחר מכן לחץ פעמיים על הסמלים עבור דיודה פולטת אור, המוקד להתאים, ואת השלב נע כדי לפתוח את הצגים שלהם גם כן. ראשית שני מרחבי זכוכית על מגלשת הזכוכית של המכסה התחתון.העבר 20 microliters, Dextran שהוכן בעבר בתוספת מתלים תא על החלקת זכוכית כיסוי התחתון. לאחר מכן מקם את מחוון הזכוכית העליון על הרווחים המכסים את מתלי התא. מניחים את תא המדגם על העדשה המטרה התחתונה עם 10 microliters של מים מזוקקים עבור מיקרוסקופ טבילה במים.חבר את עדשת המטרה העליונה בחלק העליון של תא המדגם באמצעות 10 microliters של מים מזוקקים. לאחר מכן, לחץ על לחצן ההפעלה בחלון התאורה של המיקרוסקופ כדי להפעיל את ה-LED. לחץ על לחצני הכיוון בחלון מיקום המטרה כדי להתאים את המרחק בין המדגם לבין עדשת המטרה התחתונה עד שהוא בפוקוס.הגדר את העוצמה של כל קרן לייזר ל-1500 מילי-וואט בחלון ההטמקה של האות. לאחר מכן, לחץ על שני סמלי הלייזר כדי להקרנת קרני הלייזר במיקום אחד ולמקם שני. לחץ על לחצני הכיוונים בחלון מיקום המדגם כדי להזיז את שלב הדגימה עד שתא נלכד במיקום אחד.לחץ וגרור את הסמן המציין מיקום שני עד שתא אחר נלכד במיקום 2. כדי להתחיל, טפל בתא בודד, כך שהוא יהיה במגע עם תא אחר. שמור על מצב זה למשך 300 שניות, כך שהתא ייחשף ללייזר למשך 300 שניות.הקלט את ציר ה- x-y. השמן תא אחר והעבר אותו לשני התאים הראשונים כדי לבנות הרכבה שרירותית של תא דו-מימדי. לאחר מכן הזז את הבמה למעלה ולמטה כדי לבנות הרכבה סלולרית תלת-מימדית.ודא שההרכבה עדיין יציבה גם לאחר כבה הלייזר. במחקר זה פולימרים מסיסים משמשים בבניית מכלי תא יחיד 3D. מבנה לדוגמה שנוצר באמצעות פינצטה אופטית קרן כפולה מוצג כאן.אם הניסוי יצליח, המכלולים התאיים הללו יישארו יציבים גם לאחר כבה הלייזר. מתודולוגיה חדשה זו היא לבניית מכלילים תאיים תלת מימדיים במדיום מים עם פולימר הידרופילי טבעי. הוא צפוי מאוד להתחיל בבניית סוג כזה של מכלול סלולרי מהדור הבא עם כמה מה כלים רבי עוצמה בתחום הרפואה הרגנרטיבית והנדסת רקמות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

מדידות העברת אנרגיה תהודה Förster בתאי צמח חיים

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

גישה מקיפה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...