Name: manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

लेखक Ohta विश्वविद्यालय में शू Hashimoto, Aoi योशिदा, और Taeko Doshisha प्रयोगात्मक सेटअप के साथ उनके उदार सहायता के लिए धंयवाद । यह काम KAKENHI द्वारा समर्थित (15H02121, 15K05400, २५१०३०१२, ५०५८७४४१) और MEXT द्वारा निजी विश्वविद्यालयों में सामरिक अनुसंधान फाउंडेशन के लिए कार्यक्रम का समर्थन किया था । यह अध्ययन भी पता (अग्रणी राष्ट्रीय अनुसंधान केंद्र) वैज्ञानिक कंसोर्टियम "स्वस्थ पशु-सुरक्षित भोजन" से एक पोलिश अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय के निर्णय No. 05-1/KNOW2/2015..

1. कोशिकाओं की तैयारी
<ol><li>बनाए रखने नमृ माउस स्तन ग्रंथि उपकला कोशिकाओं (NMuMG कोशिकाओं) के साथ डी की 5 मिलीलीटर-मेम 10% (v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% (v) पेनिसिलिन-Streptomycin (पी/एस) एक 25 सेमी3 कुप्पी में. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (डी-मेम) को निकालें, जिसमें 10% FBS और 1% P/</li>
	<li>कुप्पी के लिए ३७ ° c फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 3-5 मिलीलीटर जोड़ें (-) । ध्यान दें कि पंजाबियों का पीएच 7.1-7.3 है ।</li>
	<li>एक aspirator का उपयोग कर कुप्पी से सभी पंजाबियों को हटा दें ।</li>
	<li>कुप्पी में ३७ ° c trypsin (०.२५%, w/v) की १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।</li>
	<li>एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1-2 मिनट के लिए कुप्पी मशीन ।</li>
	<li>10% FBS युक्त डी-मेम की ३.५ मिलीलीटर जोड़ें और कुप्पी के लिए 1% P/ पिपेट मिश्रण.</li>
	<li>एक 15 मिलीलीटर के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक ट्यूब स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए यह केंद्रापसारक । ध्यान दें कि रोटेशन त्रिज्या और रोटेशन की गति के केंद्रापसारक १६.६ सेमी और १५०० rpm, क्रमशः कर रहे हैं । इस हालत के तहत, रिश्तेदार केंद्रापसारक बल ४१७ एक्स जी है ।</li>
	<li>मध्यम aspirating (यदि आवश्यक हो, cryopreservation समाधान के साथ कोशिकाओं cryopreserve, निर्माता के निर्देशों का पालन) के बाद कुप्पी के लिए ताजा डी-मेम (10% FBS और 1% P/S) के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।</li>
</ol>2. Dextran (DEX) की तैयारी
<ol><li>डी-मेम (10% FBS, 1% P/S) और DEX के ०.८ g के 10 मिलीलीटर को मिलाकर DEX सॉल्यूशन के ८० मिलीग्राम/एमएल तैयार करें । ध्यान दें कि DEX समाधान एक सिरिंज फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया जा सकता (०.२२ µm) के बाद कोशिकाओं को एक पर्याप्त समय के लिए संस्कृति है ।</li>
	<li>४० मिलीग्राम/एमएल DEX माध्यम से युक्त एक सेल सस्पेंशन तैयार करें जिसमें २०० µ l का DEX सॉल्यूशन और २०० µ l का २.१ में तैयार किया गया सेल सस्पेंशन का मिश्रण है । ध्यान दें कि समाधान में कोशिकाओं की संख्या घनत्व लगभग 2.3 × 105 कोशिकाओं/</li>
</ol>3. लेजर और माइक्रोस्कोपी के लिए तैयारी
<ol><li>लेजर चालू करें (निरंतर तरंग, १,०६४ एनएम तरंग दैर्ध्य) (चित्रा 1ए) । ध्यान दें कि लाल रंग में एक तरंग दैर्ध्य के निकट अवरक्त क्षेत्र के साथ एक लेज़र बीम का उपयोग सबसे प्रभावी है; यह तरंग दैर्ध्य क्षेत्र नैदानिक और चिकित्सकीय खिड़की10 कहा जाता है क्योंकि यह न्यूनतम कोशिकाओं द्वारा अवशोषित कर लेता है ।</li>
	<li>सॉफ़्टवेयर चिह्न को डबल-क्लिक करें ।</li>
	<li>① कैमरा के लिए चिह्न डबल-क्लिक करें, ② प्रकाश उत्सर्जक डायोड (LED), ③ फ़ोकस समायोजित, और ④ चलती अवस्था । प्रदर्शित करने के लिए इसी ①-④ दिखाई देगा (चित्रा 1ख) ।</li>
</ol>4. सेल लेजर ट्रैपिंग प्रणाली का उपयोग हेरफेर
<ol><li>नीचे कवर ग्लास (०.१७ mm मोटाई, पर चरण २.२ में तैयार किए गए नमूने के 20 µ एल प्लेस, आकार = 30 मिमी × ४० मिमी), और शीर्ष कवर ग्लास (०.१७ mm मोटाई, आकार = 18 मिमी × 18 मिमी) के साथ कवर, जुदाई के साथ दो स्पेसर द्वारा प्रदान की (०.१७ mm मोटाई , आकार = 10 मिमी × 24 मिमी), चित्रा 2में दिखाया गया के रूप में. ध्यान दें कि इन चश्मे एक विशेष कोटिंग की आवश्यकता नहीं है ।</li>
	<li>निचले उद्देश्य लेंस पर कदम ४.१ में तैयार नमूना सेल प्लेस (सीए के साथ जल विसर्जन. 10 μl, आवर्धन = 60X, कार्य दूरी = ०.२८ mm, संख्यात्मक एपर्चर = १.२)) ।</li>
	<li>ऊपरी उद्देश्य लेंस संलग्न (सीए के साथ जल विसर्जन. 10 μl, आवर्धन = 60X, काम की दूरी = 2 मिमी, संख्यात्मक एपर्चर = १.०) नमूना सेल के शीर्ष पर ।</li>
	<li>चिह्न 2 (चित्र 1b) पर क्लिक करके LED लाइट चालू करें.</li>
	<li>3 पैनल (चित्रा 1ख) जब तक यह ध्यान में है पर माउस को आइकनों पर क्लिक करके नमूना और कम उद्देश्य लेंस के बीच की दूरी को समायोजित करें ।</li>
	<li>विकीर्ण 1 और 2 स्थान पर लेजर मुस्कराते हुए (चित्रा 1ख) चिह्न मैं, द्वितीय, और III (चित्रा 1ख) पर क्लिक करके नमूने के ।</li>
	<li>आइकन IV (चित्रा 1ख) में इस मूल्य में प्रवेश करके १,५०० मेगावाट के लिए प्रत्येक लेजर बीम की तीव्रता निर्धारित करें ।</li>
	<li>आइकन 4 पर क्लिक करके नमूना चरण ले जाएँ दिशा निर्देश (चित्रा 1ख) जब तक एक सेल 1 स्थिति (चित्रा 1ख) पर फंस गया है.</li>
	<li>स्थिति 2 (चित्रा 1ख) जब तक दूसरे सेल 2 स्थिति में फंस गया है का संकेत कर्सर खींचें ।</li>
</ol>5. एक 3 आयामी (3 डी) सेल संरचना का निर्माण
<ol><li>किसी एकल कक्ष में हेरफेर करें जिससे वह किसी अंय कक्ष से संपर्क में हो । ३०० s के लिए इस शर्त को बनाए रखें; यानी, प्रत्येक कोशिका ३०० एस के लिए एक लेजर के संपर्क में है ।</li>
	<li>चित्र 1bमें दर्शाए गए X-Y अक्ष को रिकॉर्ड करना ।</li>
	<li>फँसाने और कोशिकाओं के लिए एक और सेल परिवहन द्वारा एक मनमाना 2d सेल विधानसभा का निर्माण ।</li>
	<li>मंच ऊपर और नीचे ले जाकर एक 3 डी सेलुलर विधानसभा का निर्माण ।</li>
	<li>पुष्टि करें कि असेंबली लेज़र स्विच है बंद करने के बाद स्थिर रहता है ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold:+an+in+vitro+study.">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers.">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577 (2015).</li><li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel.">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li><li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation.">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li><li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells.">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li><li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+heterotypic+spheroid+model+for+studying+extracellular+vesicle-mediated+tumor+and+immune+cell+communication.">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+living+cells+to+construct+a+3D+single-cell+assembly+without+an+artificial+scaffold.">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319 (2017).</li><li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photothermolysis:+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation.">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li><li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Stable+Cell-Cell+Contact+without+a+Solid/Gel+Scaffold:+Non-invasive+Manipulation+by+Laser+under+Depletion+Interaction+with+a+Polymer.">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li><li>Rauch, P., J&#228;hnke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Tweezers+for+Quantitative+Force+Measurements+and+Live+Cell+Experiments.">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li><li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilt+control+in+optical+tweezers.">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

वर्तमान अध्ययन 3 डी एकल सेल विधानसभाओं के निर्माण के लिए घुलनशील पॉलिमर के उपयोग पर हमारे हाल ही में9रिपोर्ट,11 के एक ठोस आवेदन से पता चलता है । इस तरह के विधानसभाओं छुरा थोक समाधान में गठन कर रहे है जब कोशिकाओं की संख्या 10 तक है, और एक एकल लेजर बीम द्वारा आयोजित किया जा सकता है । जब 10 से अधिक कक्ष हैं, तो असेंबलीज़ कांच की सतह पर हाला । हालांकि प्रयोग एक आदिम अवस्था में अब भी कर रहे हैं, हम उंमीद है कि उपंयास पद्धति अगली पीढ़ी के 3 डी एकल सेल विधानसभाओं, जो कोशिका जीवविज्ञान के क्षेत्र में प्रगति के लिए अपरिहार्य है और निर्माण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है अपक्षय चिकित्सा ।
एक समाधान में कोई बहुलक युक्त, कोशिकाओं को एक दूसरे की वजह से सतह प्रभारी, जलयोजन प्रतिकारक बल, glycocalyx प्रतिकारक प्रभाव, और झिल्ली undulat से उत्पंन इलेक्ट्रोस्टैटिक repuls के पीछे हटाना । हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि सेल जोड़े एक लंबे समय के लिए स्थिर किया जा सकता है जब कोशिकाओं खूंटी के साथ इलाज कर रहे हैं । इससे भी महत्वपूर्ण बात, खूंटी के बिना एक क्षेत्र के लिए एक सेल जोड़ी के सफल परिवहन, के बाद कोशिकाओं के संपर्क में खूंटी में 5 मिनट के लिए आयोजित किया गया था, पता चलता है कि सेलुलर संपर्क एक स्थिर तरीके से बनाए रखा है । यह अच्छी तरह से घट प्रभाव11के संदर्भ में समझाया गया है, और अनिवार्य रूप से एक ही तंत्र DEX9का उपयोग कर उत्पन्न सेलुलर विधानसभाओं के लिए लागू होता है. हमारे वर्तमान परिणाम सुझाव है कि प्राकृतिक अणुओं के अंय प्रकार भी स्थिर 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कोशिकाओं के त्वरित परिवहन के लिए, बहुलक की एकाग्रता महत्वपूर्ण है । आम तौर पर, समाधान की चिपचिपाहट तेजी से बढ़ जाती है जब बहुलक ओवरलैप एकाग्रता के ऊपर भंग है । इस शर्त के तहत, यह ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए मुश्किल है । इसलिए, प्रयोग को ओवरलैप एकाग्रता के नीचे किया जाना चाहिए । एक DEX समाधान के लिए, ओवरलैप एकाग्रता ca है । ५० मिलीग्राम/एमएल (काइनेटिक चिपचिपापन है ५.५ mm2/ के रूप में रेफरी .9 में दिखाया गया है, एक स्थिर सेलुलर विधानसभा मनाया जब DEX की एकाग्रता था 10 मिलीग्राम/एमएल करने के लिए ४० मिलीग्राम/एमएल । इस परिणाम से पता चलता है कि घट प्रभाव को पर्याप्त रूप से स्थिर सेल-सेल संपर्क बनाए रखने के लिए भी जब DEX एकाग्रता ओवरलैप एकाग्रता से कम है बड़ा है । यह दिखाया गया है कि DEX के अलावा सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है अप करने के लिए ४० मिलीग्राम/
3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए एक विधि की स्थापना एक सेल संरचना द्वारा vivo सेलुलर microenvironment में नकल उतार के बाद से अपक्षयी दवा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण है, स्टेम सेल व्युत्पंन ऊतक की सुविधा हो सकती है गठन. अब तक, हम NMuMG कोशिकाओं के अलावा Neuro2A कोशिकाओं9 का उपयोग सेलुलर विधानसभाओं का निर्माण करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है. हम विभिंन morphologies की कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए एक प्रायोगिक पद्धति स्थापित करने की उंमीद है । Ichikawa एट अल द्वारा विकसित ऑप्टिकल चिमटी प्रणाली । 13 इस प्रयोजन के लिए लागू किया जाएगा के बाद से कोशिकाओं के उंमुखीकरण को नियंत्रित किया जा सकता है । इन पंक्तियों के साथ आगे परीक्षण का वादा किया जाना चाहिए ।

जबकि मानव ऊतकों कोशिकाओं के कई सभाओं से बना है और शरीर के homeostasis बनाए रखने में मदद कर सकते हैं, खुद के द्वारा एकल कोशिकाओं को भी सेल से सेल संपर्क के माध्यम से महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसलिए, यह स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कैसे एकल कोशिकाओं को बाहरी संकेतों से उत्तेजित किया जा सकता है और कैसे वे अन्य अनुयाई कोशिकाओं के लिए इस तरह के संकेतों को हस्तांतरण. इस प्रयोजन के लिए, एकल-कक्ष-आधारित 3-आयामी (3d) असेंबली के निर्माण के लिए कई विधियाँ स्थापित की गई हैं1,2,3,4,5,6 ,7,8. हालांकि, सामग्री है कि सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है अभी भी सुधार किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) सहित सिंथेटिक जैल और पॉलिमर कुछ रासायनिक भौतिक गुणों के अधिकारी हैं और लक्ष्य कोशिकाओं (जैसे, विषाक्तता) को प्रभावित कर सकते हैं ।
हमने हाल ही में एक उपंयास प्रणाली है कि एक एकल-सेल आधारित कोशिकाओं के 3 डी विधानसभा dextran (DEX) का उपयोग स्थिर सेल-सेल संपर्क9स्थापित करके उत्पंन कर सकता है की सूचना दी । हमने माना है कि इस प्रौद्योगिकी के कई अनुसंधान क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है, अपक्षयी चिकित्सा और यहां तक कि कैंसर जीव विज्ञान सहित । इस रिपोर्ट में, हम वर्णन कैसे हम एकल कोशिकाओं में हेरफेर और 3 आयामी निर्माण (3 डी) एक कृत्रिम पाड़ के बिना DEX सहित विभिंन हाइड्रोफिलिक biomacromolecules की उपस्थिति में सेलुलर असेंबलियों ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Microscope IX71</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX71</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dextran(200,000; molecular biology-grade)</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">CAS.NO&#160; 9004-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Laser Trapping System (NanoTracker 2)</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">S/N T-05-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Upper Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">LUMPLFLN60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lower Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">UPLSAPO60XW</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Top Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C022401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Intermediate Cover Glass (Spacer)</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>custom-made (size = 10mm&#215;10mm, thickness = 0.17mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Bottom Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C030401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Camera</td>
			<td style="width:124px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:136px;">DFK 31AF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Software</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">NanoTracker2 PFM software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NMuMG cells&#160;</td>
			<td style="width:124px;">RIKEN BRC</td>
			<td style="width:136px;">RCB2868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PBS</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Cell banker</td>
			<td style="width:124px;">Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td style="width:136px;">ZR621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">D-MEM</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:279px;">FBS</td>
			<td style="width:124px;">Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td>
			<td style="width:136px;">172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">161-23181</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold

अपक्षयी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग असभ्य रोगों के उपचार के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं, और कई अध्ययनों से इन क्षेत्रों में 3 आयामी (3 डी) सेलुलर सभाओं के महत्व को प्रदर्शित किया है । कृत्रिम पाड़ों अक्सर 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, पाड़ों सेलुलर विधानसभाओं का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कभी विषैले और कोशिकाओं के गुणों को बदल सकते हैं । इस प्रकार, यह सेल सेल संपर्क की सुविधा के लिए एक गैर विषैले विधि स्थापित करने के लिए फायदेमंद होगा । इस पत्र में, हम dextran के साथ ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके स्थिर सेलुलर सभाओं के निर्माण के लिए एक उपंयास विधि का परिचय । इस विधि के लाभों में से एक यह है कि यह एक कुछ मिनट के भीतर स्थिर सेल से सेल संपर्क स्थापित करता है । इस नई विधि एक प्राकृतिक हाइड्रोफिलिक बहुलक में 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण की अनुमति देता है और अगली पीढ़ी के 3 डी एकल अपक्षयी दवा और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्रों में सेल विधानसभाओं के निर्माण के लिए उपयोगी होने की उंमीद है ।

चित्रा 1 इस अध्ययन में प्रयुक्त माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर से पता चलता है. चित्रा 2 नमूना समाधान कोशिकाओं से युक्त रखने के लिए प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है । चित्रा 3 डबल बीम ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कर एक पिरामिड संरचना के गठन को दर्शाता है । यदि प्रयोग सफल होता है, तो लेजर स्विच ऑफ होने के बाद भी ये सेलुलर असेंबली स्थिर रहती हैं ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> चित्रा 1 : (क) लेजर ट्रैपिंग प्रणाली के लिए नियंत्रण प्रणाली (NanoTracker2 (11)) । सिस्टम लेजर स्विच पर मोड़ द्वारा सक्रिय है कदम ①-③ निंनलिखित । (ख) लेजर ट्रैपिंग प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर । कैमरा, एलईडी लाइट, फोकस समायोजित करें, और चलती स्टेज क्रमशः माउस ①, ②, ③, और ④, क्लिक करके सक्रिय कर रहे हैं । सूक्ष्म छवि 1 पैनल में प्रदर्शित किया जाता है । एलईडी के लिए ऑन/ऑफ कंट्रोल पैनल 2 में है । ध्यान 3 पैनल में नियंत्रित किया जाता है । लेजर मुस्कराते हुए 1 और 2 पदों पर विकिरणित है माउस को आइकनों मैं IV पर क्लिक करके । इस लेजर ट्रैपिंग का विवरण रेफरी में प्रदान की Systemare (12) । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> चित्रा 2: प्रतिनिधि स्लाइड ग्लास रखने के लिए योजनाबद्ध । नमूने के 20 µ एल (सेल dextran युक्त निलंबन) स्लाइड पर रखा गया है और लेजर हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> चित्रा 3 : a) असेंबली की उपकला कोशिकाओं (NMuMG) DEX के साथ एक माध्यम में एक इच्छित आकार का (४० mg/एमएल): पिरामिड एक 3d क्लस्टर का एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है । ख) पिरामिड के आकार का 3d सेलुलर असेंबली का एक योजनाबद्ध आंकड़ा भी दिखाया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

हम एक कृत्रिम पाड़ के बिना एक एकल सेल आधारित 3 आयामी (3 डी) विधानसभा के निर्माण के लिए एक उपंयास विधि प्रदर्शित करता है ।

कृत्रिम पाड़ के बिना स्थिर 3 डी सेलुलर विधानसभा का निर्माण करने के लिए जीवित कोशिकाओं को जोड़ तोड़

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

यह उपन्यास पद्धति हमें स्थिर सेल-सेल संपर्क स्थापित करके, गैर-विशिष्ट हाइड्रोफिलिक बहुलक युक्त जलीय बफर समाधान में वांछित व्यक्तिगत कोशिकाओं से अनुकूलित त्रि-आयामी विधानसभाओं का निर्माण करने की अनुमति देती है। इस वीडियो में, हम प्रदर्शित करेंगे कि हम वांछित एकल कोशिकाओं में हेरफेर कैसे करते हैं और कृत्रिम पाड़ के बिना 3 डी सेलुलर असेंबली का निर्माण करते हैं। यहां हम एक उदाहरण के रूप में डेक्सट्रान के साथ अपने माध्यम में प्रायोगिक प्रक्रिया दिखाएंगे ।शुरू करने के लिए, दो से तीन दिनों के लिए 25 घन सेंटीमीटर फ्लास्क में, डीएमईएम के पांच मिलीलीटर के साथ NAMRU माउस स्तन ग्रंथि एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाए रखें, जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं। जब आगे बढ़ने के लिए तैयार है, पूरक DMEM को हटाने के लिए एक एस्पिेटर का उपयोग करें और पीबीएस के तीन से पांच मिलीलीटर जोड़ें, जो कोशिकाओं को धोने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम है । एक एस्पिरेटर का उपयोग करके, सभी पीबीएस को फ्लास्क से हटा दें।37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम है कि ट्रिप्सिन के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। कम से कम एक से दो मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक CO2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट। इसके बाद, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन वाले डीएमईएम के 3.5 मिलीलीटर जोड़ें।मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट। सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 417 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। इसके बाद माध्यम को एएसपीरेट करें।10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त ताजा डीएमईएम के पांच मिलीमीटर जोड़ें। और यदि आवश्यक हो, तो निर्माता के निर्देशों द्वारा उल्लिखित कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्विजर्व करने के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन समाधान का उपयोग करें। पहले 80 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर डेक्सट्रान समाधान तैयार करने के लिए 0.8 ग्राम डेक्सट्रान के साथ 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम के 10 मिलीलीटर मिलाएं।पहले से तैयार सेल सस्पेंशन के 200 माइक्रोलीटर के साथ इस डेक्सट्रान सॉल्यूशन के 200 माइक्रोलीटर मिलाएं, जिसमें 40 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर डेक्सट्रान माध्यम होता है। शुरू करने के लिए, लेजर चालू करें, ध्यान दें कि लाल से निकट अवरक्त क्षेत्र में तरंगदैर्ध्य के साथ लेजर बीम का उपयोग सबसे प्रभावी है। इसके बाद सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करके सॉफ्टवेयर खोलें।कैमरे के लिए आइकन पर डबल क्लिक करें और ध्यान दें कि संबंधित डिस्प्ले पॉप अप होगा। फिर प्रकाश उत्सर्जक डायोड के लिए माउस पर डबल क्लिक करें, फोकस समायोजित करें, और उनके डिस्प्ले को खोलने के लिए चलती हुई स्थिति भी। नीचे कवर ग्लास स्लाइड पर पहले दो ग्लास स्पेसर्स रखें।20 माइक्रोलीटर ट्रांसफर करें, पहले से तैयार डेक्सट्रान ने बॉटम कवर ग्लास स्लाइड पर सेल सस्पेंशन को सप्लीमेंट किया । फिर सेल निलंबन को कवर करने वाले स्पेसर्स पर शीर्ष कवर ग्लास स्लाइड रखें। पानी विसर्जन माइक्रोस्कोपी के लिए आसुत पानी के 10 माइक्रोलीटर के साथ निचले उद्देश्य लेंस पर नमूना सेल रखें।आसुत पानी के 10 माइक्रोलीटर का उपयोग कर नमूना सेल के शीर्ष पर ऊपरी उद्देश्य लेंस संलग्न करें। इसके बाद, एलईडी चालू करने के लिए माइक्रोस्कोप रोशनी विंडो में ऑन-ऑफ बटन पर क्लिक करें। नमूना और निचले उद्देश्य लेंस के बीच की दूरी को समायोजित करने के लिए उद्देश्य स्थिति खिड़की में दिशा बटन पर क्लिक करें जब तक कि यह ध्यान में न हो।सिग्नल तनु खिड़की में 1500 मिलीवाट करने के लिए प्रत्येक लेजर बीम की तीव्रता निर्धारित करें। फिर, दो लेजर माउस पर क्लिक करें स्थिति एक और स्थिति दो पर लेजर मुस्कराते हुए विकिरणित करने के लिए । नमूना स्थिति खिड़की में दिशात्मक बटन पर क्लिक करें नमूना चरण को स्थानांतरित करने के लिए जब तक एक सेल एक स्थिति में फंस गया है ।क्लिक करें और कर्सर को दो स्थिति का संकेत देते हुए खींचें जब तक कि एक और सेल दो स्थिति में फंस न जाए। शुरू करने के लिए, एक सेल में हेरफेर करें, ताकि यह किसी अन्य सेल के संपर्क में हो। 300 सेकंड के लिए इस स्थिति को बनाए रखें, ताकि सेल 300 सेकंड के लिए एक लेजर के संपर्क में हो।एक्स-वाई-एक्सिस रिकॉर्ड करें। एक और सेल जाल और यह एक मनमाने ढंग से 2 डी सेल विधानसभा का निर्माण करने के लिए पहले दो कोशिकाओं के लिए परिवहन । फिर 3 डी सेलुलर असेंबली बनाने के लिए मंच को ऊपर और नीचे ले जाएं।पुष्टि करें कि लेजर बंद होने के बाद भी विधानसभा स्थिर है। इस अध्ययन में घुलनशील पॉलिमर का उपयोग 3 डी एकल सेल विधानसभाओं के निर्माण में किया जाता है। डबल बीम ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करके बनाई गई एक उदाहरण संरचना यहां दिखाई गई है।यदि प्रयोग सफल होता है, तो लेजर बंद होने के बाद भी ये सेलुलर असेंबली स्थिर रहती हैं। यह नई पद्धति प्राकृतिक हाइड्रोफिलिक बहुलक के साथ एक जलीय माध्यम में 3 डी सेलुलर विधानसभाओं के निर्माण के लिए कर रहे हैं । यह बहुत पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में शक्तिशाली उपकरणों में से कुछ के साथ अगली पीढ़ी सेलुलर विधानसभाओं के इस तरह के निर्माण शुरू करने की उम्मीद है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर आणविक प्रसार के विश्लेषण के लिए स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

ग्रेडिएंट मेकर्स या फ्रैक्शनेशन सिस्टम के बिना पॉलीसोम प्रोफाइलिंग

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण जीवित संयंत्र कोशिकाओं में माप

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग झिल्ली-संबद्ध Macromolecule Dynamics को चिह्नित करने के लिए

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स की स्व-असेंबली

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

बायोफिजिकल गुणों और कार्यों का अध्ययन करने के लिए झिल्ली में सेप्टिन असेंबली का पुनर्गठन

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

सेरेब्रल रक्त के थक्कों के कोशिका घटकों का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...