Name: manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00
Duration: 7 min 9 s
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著者は実験のセットアップを彼らの寛大な支援ありがとう集橋本、葵吉田妙子同志社大学の太田。この仕事は、費 (15 H 02121、15 K 05400、25103012、50587441)、MEXT-Supported プログラムを私立大学戦略的研究基盤のサポートされていました。本研究は、知っている (主要な国立研究センター) の科学コンソーシアム」健康な動物 -「食の安全、科学高等教育第 05-1/KNOW2/2015 省の決定からポーランドの助成金に支えられ.

1. 細胞の調製
<ol><li>D MEM 含む 10% (v) ウシ胎児血清 (FBS) の 1% (v) ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) 25 cm3フラスコ 5 mL と NAMRU マウス乳腺上皮細胞 (NMuMG 細胞) を維持します。削除ダルベッコ修飾イーグル培地 (D-MEM)、10 %fbs および 1% を含む P/s.</li>
	<li>37 ° C リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (-) 3-5 mL をフラスコに追加します。PBS の pH が 7.1 7.3 であることに注意してください。</li>
	<li>アスピレーターを使用してフラスコからすべての PBS を削除します。</li>
	<li>37 ° C トリプシン 0.25% (w/v) 1.5 mL をフラスコに追加します。</li>
	<li>フラスコ CO2インキュベーターで 37 ° C で約 1-2 分間インキュベートします。</li>
	<li>追加 10 %fbs および 1% を含む D MEM の 3.5 mL フラスコに P/S。ピペットをミックスします。</li>
	<li>15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送し、室温で 3 分間遠心します。回転半径と遠心分離機の回転速度は、16.6 cm 1500 rpm、それぞれに注意してください。この条件の下で相対的なの遠心力は 417 x g です。</li>
	<li>新鮮な D MEM の 5 mL を追加 (10 %fbs と 1 %p/S) 培地を吸引後フラスコに (必要な場合、凍結細胞凍結保存ソリューションで、製造元の指示に従って)。</li>
</ol>2. デキストラン (DEX) の準備
<ol><li>D MEM の 10 mL を混合することによって DEX 液 80 mg/mL を準備 (10 %fbs、1%P/S) と DEX の 0.8 グラム。シリンジ フィルター (0.22 μ m) でフィルター処理することができますは DEX ソリューション、細胞が十分な時間培養した後。</li>
	<li>DEX 溶液 200 μ L と 2.1 で作製した細胞懸濁液 200 μ L を混合することによって 40 mg/mL DEX 媒体を含んでいる細胞懸濁液を準備します。ソリューション内のセルの数密度は約 2.3 × 105セル/mL。</li>
</ol>3. レーザー、顕微鏡のための準備
<ol><li>(連続波、1,064 nm) のレーザーを入れます (図 1、)。赤色近赤外領域からの波長を持つレーザー光の使用が最も効果的なことに注意してください。この領域の波長は、それは最低限細胞に吸収されるので診断と治療ウィンドウ10と呼ばれます。</li>
	<li>ソフトウェア アイコンをダブルクリックします。</li>
	<li>(1) カメラ、(2) 発光ダイオード (LED)、(3) フォーカス アイコンを調整をダブルクリック、(4) ステージを移動します。(1)-(4) に対応するが表示されますが表示されます (図 1b)。</li>
</ol>4 レーザー トラップ システムを使用して細胞操作
<ol><li>手順 2.2 下のカバーガラス上で調製した試料の場所 20 μ L (厚さ 0.17 mm、サイズ = 30 mm × 40 mm)、トップ カバー ガラスでカバー (厚さ 0.17 mm、サイズ = 18 mm × 18 mm)、2 つのスペーサー (厚さ 0.17 mm によって提供される分離、サイズ = 10 mm × 24 mm)、図 2に示すように。これらのガラスに特殊なコーティングが必要としないことに注意してください。</li>
	<li>手順 4.1 低い対物レンズで作製したサンプルにセルを配置 (ca. 10 μ l、倍率と浸漬を水 60 X、作動距離を = = 0.28 mm、開口数 = 1.2))。</li>
	<li>上部の対物レンズを添付 (ca. 10 μ l、倍率と浸漬を水 = 60 X、作動距離 2 mm、開口を = = 1.0) サンプル セルの上部に。</li>
	<li>LED ライトを点灯アイコン 2 (図 1b) をクリックします。</li>
	<li>パネル 3 (図 1b) のアイコンをクリックして、サンプルと低い対物レンズ間の距離を調整するまで、それが焦点に。</li>
	<li>I、II、および III (図 1b) アイコンをクリックして、位置 1 と位置 2 (図 1B) サンプルのレーザー光を照射します。</li>
	<li>各レーザー ビームの強度を 1,500 に設定アイコン IV (図 1b) にこの値を入力して mW。</li>
	<li>セルまで 4 のアイコンを示す方向 (図 1b) をクリックしてサンプル ステージは位置 1 (図 1b) に閉じ込められて移動します。</li>
	<li>ドラッグして、別のセルまでの位置 2 (図 1b) を示すカーソルが 2 位に閉じ込められました。</li>
</ol>5、3 次元 (3 D) セル構造の建設
<ol><li>単一のセルを操作して別のセルに接触しています。300 のこの状態を維持 s;すなわち、各セルが 300 のためのレーザーにさらされている s。</li>
	<li>図 1bに示すように X と Y 軸を記録します。</li>
	<li>トラップし、セルに別のセルを輸送して任意の 2 D セル アセンブリを構築します。</li>
	<li>ステージを上下に移動することによって、3 D 携帯電話アセンブリを構築します。</li>
	<li>レーザーはオフ後アセンブリが安定していることを確認します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold:+an+in+vitro+study.">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers.">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577 (2015).</li><li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel.">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li><li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation.">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li><li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells.">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li><li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+heterotypic+spheroid+model+for+studying+extracellular+vesicle-mediated+tumor+and+immune+cell+communication.">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+living+cells+to+construct+a+3D+single-cell+assembly+without+an+artificial+scaffold.">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319 (2017).</li><li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photothermolysis:+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation.">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li><li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Stable+Cell-Cell+Contact+without+a+Solid/Gel+Scaffold:+Non-invasive+Manipulation+by+Laser+under+Depletion+Interaction+with+a+Polymer.">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li><li>Rauch, P., J&#228;hnke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Tweezers+for+Quantitative+Force+Measurements+and+Live+Cell+Experiments.">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li><li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilt+control+in+optical+tweezers.">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

本研究は、単一セルの 3 D アセンブリの建設のための水溶性ポリマーの使用で私たちの最近のレポートの9,11の具体的なアプリケーションを示しています。このようなアセンブリは安定して一括ソリューションで形成される細胞の数が最大 10、単一のレーザービームが保持できるとき。以上 10 個のセルがある場合、アセンブリはガラス表面に沈殿させます。実験がまだ原始的な段階で、我々 は新しい方法論が細胞生物学の分野での発展に欠かせない次世代 3 D 単一細胞アセンブリの構築のための強力なツールをかもしれない期待と再生医療。
ポリマーを含まない溶液、細胞は表面電荷、水和の反発力、糖衣反発効果及び膜から生じる静電斥力による互いを撃退します。私たちの以前の研究は、細胞を PEG で処理とき長い時間のセルのペアを安定にすることができますを示した。もっと重要なは、ペグ、セルは、固定で 5 分間接触で開催されていた後なし領域にセルのペアの成功したトランスポートは、細胞接触が安定的に維持されることを示唆しています。これも枯渇効果11面で説明しています、本質的に同じメカニズムが DEX9を使用して生成された細胞のアセンブリに適用されます。私たちの現在の結果は、天然高分子の他の種類は、安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築するもされる可能性があることをお勧めします。
細胞の迅速輸送、高分子の濃度が重要です。一般的には、溶液の粘性は、ポリマーが重なり濃度上解散されたときを劇的に高めます。この条件下では、光ピンセットを用いた細胞を操作することは困難です。したがって、重複濃度以下実験を行わなければなりません。DEX ソリューション重なり濃度は約 50 mg/mL (動粘度が 5.5 mm2/s)。Ref. 9 のように、安定した細胞アセンブリは DEX の濃度が 10 mg/mL 40 mg/mL に観察されました。枯渇効果が DEX 濃度が重なり濃度より低い場合でも安定した細胞接触を維持するために十分に大きいことが示唆されました。それは、DEX 添加が 40 mg/mL 9までセル実行可能性に影響を与えないことが示されています。
再生医療の分野で 3 D 携帯電話アセンブリの構築のための手法の確立が重要な生体内の模倣から単一細胞の構造細胞における微小環境を促進するかもしれない組織の幹細胞由来形成します。これまでのところ、NMuMG 細胞に加えて Neuro2A セル9を使用して細胞のアセンブリを構築する議定書を使いました。様々 な形態の細胞のより多くの 3 D 携帯電話アセンブリを構築するための実験的方法論を確立してまいります。市川らによって開発された光学ピンセット システム13はこの目的のため適用されるセルの向きを制御することができますので。これらの線に沿ってさらに試験は有望なする必要があります。

ヒト組織細胞の複数のアセンブリで構成されています、体の恒常性を維持するために助けることができる、自分自身による単一細胞も再生重要な役割細胞間相互作用を介して。したがって、外部信号による単一細胞を刺激できる方法と彼らは他の付着性のセルにこのような信号を転送方法を解明することが重要です。この目的のためいくつかの方法は、単一細胞に基づく 3 次元 (3 D) アセンブリ1,2,3,4,5,6 の建設のため確立されています。 ,7,8。ただし、携帯電話アセンブリの構築に使用される材料は改善できます。たとえば、合成ゲルおよび高分子のポリエチレング リコール (PEG) を含む特定の化学物質の物理化学的性質を持っているし、標的細胞 (例えば毒性) に影響を与える可能性があります。
我々 は最近安定した細胞接触9を確立することによってデキストラン (DEX) を用いた細胞の単一細胞ベースの 3 D アセンブリを生成することが新しいシステムを報告しました。我々 は、この技術が再生医療とも癌生物学などを含むいくつかの分野で役に立つかもしれないことと見なされます。本報告では、単一セルを操作方法と人工足場なし DEX を含む様々 な親水性生体高分子の存在下での 3 次元 (3 D) 携帯電話アセンブリを構築について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Microscope IX71</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX71</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dextran(200,000; molecular biology-grade)</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">CAS.NO&#160; 9004-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Laser Trapping System (NanoTracker 2)</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">S/N T-05-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Upper Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">LUMPLFLN60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lower Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">UPLSAPO60XW</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Top Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C022401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Intermediate Cover Glass (Spacer)</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>custom-made (size = 10mm&#215;10mm, thickness = 0.17mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Bottom Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C030401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Camera</td>
			<td style="width:124px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:136px;">DFK 31AF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Software</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">NanoTracker2 PFM software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NMuMG cells&#160;</td>
			<td style="width:124px;">RIKEN BRC</td>
			<td style="width:136px;">RCB2868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PBS</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Cell banker</td>
			<td style="width:124px;">Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td style="width:136px;">ZR621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">D-MEM</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:279px;">FBS</td>
			<td style="width:124px;">Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td>
			<td style="width:136px;">172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">161-23181</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold

再生医療・組織工学を提供する難治性疾患の治療のためのいくつかの利点と、いくつかの研究は、これらのフィールドで 3 次元 (3 D) 携帯電話アセンブリの重要性を実証しています。人工足場は、携帯電話の 3 D アセンブリを構築するためしばしば使用されています。しかし、携帯電話アセンブリの構築に使用される足場が有毒なことがあります、セルのプロパティを変更することがあります。したがって、細胞間の接触を促進するための非毒性手法の確立に有益ででしょう。デキストランと光ピンセットを使用して安定した細胞アセンブリを構築する手法を紹介します。この方法の利点の 1 つは、数分以内安定した細胞間接触を確立することです。この新しいメソッドは天然の親水性高分子の 3 D 携帯電話アセンブリの建設を可能し、される再生医療や組織工学の分野における次世代 3 D シングル セル ・ アセンブリの構築に役立てる予定です。

図 1は、顕微鏡と本研究で使用されるソフトウェアを示します。図 2細胞を含むサンプル ソリューションを配置するための手順の概略であります。ダブルビーム光学ピンセットを使用してピラミッド構造の形成を図 3に示します。実験が成功した場合、レーザーがオフにした後でも、これらの細胞アセンブリは安定しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> 図 1: (a)レーザー トラップ システムの制御システム (NanoTracker2 (11))。システムは、手順 (1) (3) レーザーのスイッチをオンにしてアクティブになります。(b)レーザー トラッピング システムを制御するためのソフトウェア。カメラ、ライト、フォーカス調整、LED し、アイコン (1)、(2)、(3)、(4) をそれぞれクリックしてアクティブ化ステージを移動します。パネル 1 で顕微鏡画像が表示されます。LED のオン/オフ コントロールはパネル 2 です。フォーカスは、パネル 3 で制御されます。アイコンをクリックすると、位置 1 と 2 で照射レーザー IV に。このレーザー トラッピング システムの詳細は、参考文献 (12) で提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> 図 2: 代表的な回路図のスライド ガラスを配置すること。20 μ L のサンプル (細胞懸濁液デキストランを含む) は、スライド上に配置、レーザー操作に使用します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> 図 3:) DEX (40 mg/mL) と媒体で意図されていた形の上皮細胞 (NMuMG) のアセンブリ: ピラミッドは 3 D クラスターの例として表示されます。b)ピラミッド型の 3 D 携帯電話アセンブリの模式図を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

人工足場なしシングル ・ セル ・ ベースの 3 次元 (3 D) アセンブリを構築するための手法を示す.

人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

この新しい方法論は、我々は、安定した細胞-細胞接触を確立することにより、非特異的親水性ポリマーを含む水性緩衝液中で、所望の個々の細胞から適応した三次元集合体を構築することを可能にする。このビデオでは、目的の単一細胞を操作し、人工足場を使わずに3Dセルラーアセンブリを構築する方法を紹介します。ここでは、Dextranを例に用いた培地の実験手順を示します。まず、NAMRUマウス乳腺上皮細胞を5ミリリットルのDMEM(10%FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含む)を2〜3日間25立方センチメートルフラスコで維持する。続行する準備ができたら、アスピレーターを使用して補充されたDMEMを取り除き、3〜5ミリリットルのPBSを加え、それは細胞を洗浄するために摂氏37度に予熱されます。アスピレーターを使用して、フラスコからPBSのすべてを取り除く。摂氏37度で予熱されたトリプシンを1.5ミリリットル加えます。37°CのCO2インキュベーターで少なくとも1〜2分間インキュベートします。この後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEMの3.5ミリリットルを追加します。ピペットを上下に混ぜ合わせます。細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移し、417倍Gで室温で3分間遠心分離する。次いで、培地を吸引する。10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含む新鮮なDMEMを5ミリメートル追加します。必要に応じて、凍結保存ソリューションを使用して、メーカーの指示に従って細胞を凍結保存します。最初に10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを0.8グラムのデキストランで補ったDMEMの10ミリリットルを混ぜ、1ミリリットルのデキストラン溶液あたり80ミリグラムを調製する。このDextran溶液の200マイクロリットルを、以前に調製した細胞懸濁液の200マイクロリットルと混合し、1ミリリットルのデキストラン培地あたり40ミリグラムを含む細胞懸濁液を作成する。まず、レーザーをオンにし、赤から近赤外領域の波長を持つレーザー光を使用することが最も効果的であることに注意してください。次に、ソフトウェアアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開きます。カメラのアイコンをダブルクリックすると、対応するディスプレイがポップアップ表示されます。次に、発光ダイオードのアイコンをダブルクリックし、フォーカスを調整し、移動ステージをクリックしてディスプレイを開きます。最初に2つのガラススペーサーを底カバーガラススライドの上に置きます。20マイクロリットルを移し、以前に調製したデキストラン補充セル懸濁液をボトムカバーガラススライド上に移す。その後、上部カバーガラススライドをセルサスペンションを覆うスペーサーの上に置きます。水浸漬顕微鏡用蒸留水10マイクロリットルでサンプルセルを低対物レンズに載せよ。10マイクロリットルの蒸留水を使用して、サンプルセルの上部に上方対レンズを取り付けます。次に、顕微鏡照明ウィンドウのオンオフボタンをクリックして、LED をオンにします。目的の位置指定ウィンドウの方向ボタンをクリックして、サンプルと低い対物レンズの間の距離を、焦点が合うまで調整します。各レーザー光の強度を、信号減衰ウィンドウで1500ミリワットに設定します。次に、2 つのレーザー アイコンをクリックして、1 番目の位置と 2 番目の位置にレーザー光線を照射します。サンプル位置指定ウィンドウの方向ボタンをクリックして、セルが位置 1 に閉じ込められるまでサンプルステージを移動します。2 番目の位置を示すカーソルをクリックしてドラッグし、別のセルが 2 番目の位置に閉じ込められます。まず、1 つのセルを操作して、別のセルと接触するようにします。この状態を 300 秒間維持し、セルがレーザーにさらされるように 300 秒間続けます。x-y 軸を記録します。別のセルをトラップして最初の 2 つのセルに転送し、任意の 2D セル アセンブリを構築します。次に、ステージを上下に動かして、3D セルラー アセンブリを構築します。レーザーの電源を切ってもアセンブリが安定していることを確認します。本研究では、可溶性ポリマーが3D単細胞集合体の構築に使用される。二重ビーム光ピンセットを用いて形成された構造の例を以下に示す。実験が成功した場合、これらのセルラーアセンブリはレーザーの電源を切っても安定したままです。この新しい方法論は自然親水性ポリマーを含む水性媒体の3D細胞アセンブリの構築のための。再生医療や組織工学の分野で、強力なツールを備えた次世代セルラーアセンブリの建設を開始することが期待されています。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

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Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

植物細胞におけるフェルスター共鳴エネルギー移動測定

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

微小管タクトイドの自己組織化

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...