Name: manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

Авторы благодарят за их щедрую помощь с экспериментальной установки Шу Хасимото, Aoi Yoshida и Taeko Охта в Дошиша университете. Эта работа было поддержано KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) и программой MEXT-Supported Фонд стратегических исследований в частных университетах. Это исследование было также поддержано польского грант от знать (ведущий Национальный научно-исследовательский центр) научного консорциума «Здорового животного – безопасные продукты», решение министерства науки и высшего образования № 05-1/KNOW2/2015...

1. Подготовка клеток
<ol><li>Поддерживать NAMRU мыши молочной железы эпителиальных клеток (NMuMG) с 5 мл D-MEM содержащие 10% (v) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (v) пенициллин-стрептомицином (P/S) в колбе3 25 см. Удаление Дульбекко изменение средних орла (D-MEM), содержащие 10% FBS и 1% P/S.</li>
	<li>Добавьте 3-5 мл физиологического раствора фосфатного буфера 37 ° C (PBS) (-) в колбу. Обратите внимание, что рН PBS является 7.1-7.3.</li>
	<li>Удалите все PBS из колбы, используя отсос.</li>
	<li>Добавьте 1,5 мл трипсина 37 ° C (0,25%, w/v) в колбу.</li>
	<li>Инкубируйте Фляга для примерно 1-2 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 .</li>
	<li>Добавить 3,5 мл D-MEM, содержащие 10% FBS и 1% P/S в колбу. Пипетка для смешивания.</li>
	<li>Передать пластиковых пробирок 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 3 мин при комнатной температуре. Обратите внимание, что радиус вращения и скорость вращения центрифуги, 16,6 см и 1500 об/мин, соответственно. При этом условии относительная центробежная сила — 417 x g.</li>
	<li>Добавьте 5 мл свежего D-MEM (10% FBS и 1% P/S) на колбу после аспирационных носитель (если требуется, криоконсервации клеток с криоконсервирования решения, следуя инструкциям производителя).</li>
</ol>2. Подготовка декстрана (DEX)
<ol><li>Подготовка 80 мг/мл раствора DEX путем смешивания 10 мл D-MEM (10% FBS, 1%P/S) и 0,8 г DEX. Обратите внимание, что решение DEX могут быть отфильтрованы с помощью шприца фильтра (0.22 мкм) после того, как клетки культивировали в течение достаточного времени.</li>
	<li>Готовят суспензию клеток, содержащих 40 мг/мл DEX среднего, смешивая 200 мкл раствора DEX и 200 мкл суспензии клеток, подготовленный в 2.1. Обратите внимание, что количество плотность клеток в решении приблизительно 2.3 × 105 кл/мл.</li>
</ol>3. подготовка для лазерных и микроскопия
<ol><li>Включите лазер (непрерывная волна, волны 1064 нм)(рисунок 1). Обратите внимание, что использование лазерный луч с длиной волны в красном в ближней ИК-области регион является наиболее эффективным; Этот регион волны называют диагностического и терапевтического окна10 , так как она минимально поглощается клетками.</li>
	<li>Дважды щелкните значок программного обеспечения.</li>
	<li>Дважды щелкните Изменить значки для камеры ① ② светоизлучающих диодов (СИД), ③ фокус и ④ перемещение стадии. Отображает соответствующий ①-④ покажет вверх (рис. 1б).</li>
</ol>4. Сотовый манипуляции с использованием лазерной системы улавливания
<ol><li>Место 20 мкл образца, подготовленный на шаге 2.2 на нижней крышки стекла (0,17 мм толщина, размер = 30 × 40 мм) и покрыть ее с верхней крышки стекла (0,17 мм толщина, размер = 18 × 18 мм), с разделением, предоставляемые две распорки (0,17 мм толщина Размер = 10 × 24 мм), как показано на рисунке 2. Обратите внимание, что эти очки не требуют специального покрытия.</li>
	<li>Поместите образец клеток, подготовленный на этапе 4.1 на нижнем объектива (водные погружения с ca. 10 мкл, масштаб = 60 X, рабочее расстояние = 0,28 мм, числовая апертура = 1.2)).</li>
	<li>Прикрепите верхнюю объектива (водные погружения с ca. 10 мкл, масштаб = 60 X, рабочее расстояние = 2 мм, числовая апертура = 1,0) в верхней части ячейки выборки.</li>
	<li>Включите светодиод свет, нажав значок 2 (рис. 1б).</li>
	<li>Отрегулируйте расстояние между образцом и нижней объектива, нажав значки на панели 3 (рис. 1б) до тех пор, пока он находится в фокусе.</li>
	<li>Облучить лазерных лучей на позиции 1 и 2 (рис. 1Б) позицию выборки, нажав значки I, II и III (рис. 1б).</li>
	<li>Установите необходимую интенсивность каждого лазерного пучка до 1500 МВт, введя значение в значок IV (рис. 1б).</li>
	<li>Перемещение образцов этап, нажав значок 4 указанием направления (рис. 1б) до ячейки удерживается на позиции 1 (рис. 1б).</li>
	<li>Перетащите курсор, указывающий положение 2 (рис. 1б) до другой ячейки в ловушке в позиции 2.</li>
</ol>5. строительство 3-мерные (3D) клеточной структуры
<ol><li>Манипулировать одну ячейку, так что это контакт с другой ячейки. Сохранить это состояние для 300 s; то есть, каждая клетка подвергается воздействию лазера для 300 s.</li>
	<li>Запишите оси X-Y, показано на рисунке 1b.</li>
	<li>Постройте сборку произвольных 2D клеток путем улавливания и транспортировки другую ячейку в клетки.</li>
	<li>Постройте сборку 3D сотовой, перемещая вверх и вниз на стадии.</li>
	<li>Подтвердите, что Ассамблея остается стабильным после выключения лазера.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold:+an+in+vitro+study.">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers.">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577 (2015).</li><li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel.">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li><li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation.">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li><li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells.">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li><li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+heterotypic+spheroid+model+for+studying+extracellular+vesicle-mediated+tumor+and+immune+cell+communication.">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+living+cells+to+construct+a+3D+single-cell+assembly+without+an+artificial+scaffold.">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319 (2017).</li><li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photothermolysis:+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation.">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li><li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Stable+Cell-Cell+Contact+without+a+Solid/Gel+Scaffold:+Non-invasive+Manipulation+by+Laser+under+Depletion+Interaction+with+a+Polymer.">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li><li>Rauch, P., J&#228;hnke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Tweezers+for+Quantitative+Force+Measurements+and+Live+Cell+Experiments.">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li><li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilt+control+in+optical+tweezers.">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Настоящее исследование показывает конкретное применение наших недавних докладах9,11 на использование растворимых полимеров для строительства 3D одноклеточных сборок. Такие сборки стабильно образуются в основной раствор когда количество клеток до 10 и может нести один лазерный луч. Сборки осадок на поверхности стекла, когда есть более чем 10 клеток. Хотя эксперименты в примитивные стадии, мы ожидаем, что новая методология может быть мощным инструментом для строительства нового поколения 3D одноклеточных сборок, которые являются необходимым условием для прогресса в области клеточной биологии и регенеративной медицины.
В раствор, содержащий не полимера клетки отталкивать друг друга за счет электростатического отталкивания, вытекающих из поверхности заряд, сила отталкивания гидратации, Гликокаликс отталкивания эффект и волнистость мембраны. Наши предыдущие исследования показали, что пар клеток может быть стабильным долгое время когда клетки лечат PEG. Что еще более важно успешной перевозки пару клеток в регион без ПЭГ, после того, как клетки были проведены в контакте на 5 минут в КОЛЫШЕК, свидетельствует о том, что сотовой контакты в стабильно. Это хорошо объяснить с точки зрения истощения эффект11, и по сути тот же механизм применяется к сотовой сборок, созданных с помощью DEX9. Наши текущие результаты показывают, что другие виды естественных макромолекул также может использоваться для построения стабильной 3D сотовых сборках.
Для быстрого транспорта клеток концентрации полимера имеет важное значение. Как правило вязкость раствора резко возрастает, когда полимер растворяется выше концентрация перекрытия. При этом условии трудно манипулировать клеток с использованием Оптический пинцет. Таким образом ниже концентрации перекрытие должно выполняться эксперимент. Для решения DEX, перекрытие концентрация составляет ОК. 50 мг/мл (кинетическая вязкость — 5,5 мм2/s). Как показано в ссылка 9, стабильной сотовой Ассамблеи было отмечено, когда концентрация DEX было 10 мг/мл, 40 мг/мл. Этот результат свидетельствует о том, что эффект истощения является достаточно большим, чтобы поддерживать стабильный ячеек контакт даже тогда, когда концентрация DEX находится ниже, чем концентрация перекрытия. Было показано, что добавление DEX не влияет на жизнеспособность клеток до 40 мг/мл 9.
Создание метода для строительства 3D сотовой сборок имеет важное значение в области регенеративной медицины, поскольку передразнивать в естественных условиях сотовой микроокружения путем структурирования единичных клеток может облегчить стволовых клеток ткани формирование. Пока мы использовали настоящий протокол для построения клеточных сборок с помощью Neuro2A клетки9 дополнение к NMuMG клеток. Мы надеемся создать экспериментальную методологию для построения 3D сотовых сборках большего числа клеток различных морфологии. Оптический пинцет система, разработанная Ichikawa и др. 13 будет применяться для этой цели после ориентации клетки можно управлять. Дальнейшие испытания вдоль этих линий должны быть перспективными.

В то время как ткани человека состоит из нескольких сборок клеток и может помочь сохранить гомеостаз организма, отдельные клетки сами по себе важную роль играют также через взаимодействие к ячейке. Таким образом важно выяснить, как отдельные клетки могут стимулироваться внешних сигналов и как они передают такие сигналы других адэрентных клеток. Для этой цели были созданы несколько методов для строительства одно cell-based 3-мерные (3D) сборки1,2,3,4,5,6 ,,78. Однако материалы, которые используются для построения клеточных сборки все еще может быть улучшено. Например синтетические гели и полимеров, включая полиэтиленгликоля (PEG) обладают некоторые химические физико-химических свойств и могут влиять на клетки-мишени (например, токсичность).
Недавно мы сообщили Роман системы, которая может генерировать один cell-based 3D Ассамблеи клеток с помощью декстрана (DEX) путем создания стабильных ячеек контакт9. Мы считали, что эта технология может быть полезным в нескольких областях исследований, включая регенеративной медицины и даже биологии рака. В настоящем докладе мы описываем, как мы манипулировать единичных клеток и построить 3-мерной сотовой сборки (3D) в присутствии различных гидрофильные биомакромолекулах, включая DEX без искусственных лесов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Microscope IX71</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX71</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dextran(200,000; molecular biology-grade)</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">CAS.NO&#160; 9004-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Laser Trapping System (NanoTracker 2)</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">S/N T-05-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Upper Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">LUMPLFLN60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lower Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">UPLSAPO60XW</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Top Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C022401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Intermediate Cover Glass (Spacer)</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>custom-made (size = 10mm&#215;10mm, thickness = 0.17mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Bottom Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C030401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Camera</td>
			<td style="width:124px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:136px;">DFK 31AF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Software</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">NanoTracker2 PFM software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NMuMG cells&#160;</td>
			<td style="width:124px;">RIKEN BRC</td>
			<td style="width:136px;">RCB2868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PBS</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Cell banker</td>
			<td style="width:124px;">Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td style="width:136px;">ZR621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">D-MEM</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:279px;">FBS</td>
			<td style="width:124px;">Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td>
			<td style="width:136px;">172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">161-23181</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold

Регенеративной медицины и тканевая инженерия предлагают несколько преимуществ для лечения сложных заболеваний, и несколько исследований продемонстрировали важность 3-мерной сотовых сборках (3D) в этих областях. Искусственные леса часто используются для создания 3D сотовых сборках. Однако строительные леса, используемые для построения клеточных сборки иногда токсичны и могут изменять свойства клеток. Таким образом было бы полезно разработать метод не токсичен для облегчения контактов ячеек. В этой статье мы представляем новый метод для построения стабильных клеточных сборок с помощью Оптический пинцет с декстрана. Одним из преимуществ данного метода является, что он устанавливает стабильный контакт к ячейке в течение нескольких минут. Этот новый метод позволяет строительство 3D сотовых сборках в естественной гидрофильного полимера и, как ожидается, будет полезным для построения нового поколения 3D одноклеточных сборок в области регенеративной медицины и тканевой инженерии.

Рисунок 1 показывает микроскоп и программное обеспечение, используемое в настоящем исследовании. На рисунке 2 это схематическое представление процедуры для установки примера решения, содержащие клетки. На рисунке 3 показано формирование структуры пирамиды, с использованием двойной луч оптический пинцет. Если эксперимент выполнен успешно, эти сотовой сборки остаются стабильными, даже после выключения лазера.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> Рисунок 1 : (a) система управления для лазерной системы улавливания (NanoTracker2 (11)). Система активируется, повернув переключатель лазера, следующие шаги ①-③. (b) программного обеспечения для управления системой улавливания лазера. Камеры, свет, отрегулировать фокус, и перемещение стадии активируются нажатием иконки ① ②, ③ и ④, соответственно. Микроскопические изображение отображается в панели 1. Управления вкл/выкл для индикатор находится в панели 2. Основное внимание контролируется в группе 3. Лазерные лучи облученных в позиции 1 и 2, нажав значки I – IV. Этот лазер Systemare захвата подробно в ссылка (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> Рисунок 2: представитель схемы для размещения слайд стекла. 20 мкл пример (суспензии клеток, содержащих декстрана) размещена на слайде и используется для лазерных манипуляций. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> Рисунок 3 :) сборки эпителиальных клеток (NMuMG) предназначен формы в среде с DEX (40 мг/мл): пирамиды показано в качестве примера 3D кластера. b) Схематический рисунок пирамидальная 3D сотовой Ассамблеи также показано. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Мы продемонстрировать новый метод для построения одной cell-based 3-мерные (3D) Ассамблея без искусственных лесов.

Манипулируя живых клеток для построения стабильной 3D сотовой Ассамблеи без искусственных лесов

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Эта новая методология позволяет нам строить трехмерные сборки, адаптированные из желаемых отдельных клеток, в аквозном буферном растворе, содержащем неспецифический гидрофильные полимеры, путем установления стабильного контакта клеток и клеток. В этом видео мы продемонстрируем, как мы манипулируем желаемыми одиночными ячейками и строим 3D клеточные сборки без искусственных эшафотов. Здесь мы покажем экспериментальную процедуру в нашей среде с Dextran в качестве примера.Для начала, поддерживать NAMRU мыши молочной железы эпителиальных клеток с пятью миллилитров DMEM, содержащий 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин, в 25 кубических сантиметров колбы в течение двух-трех дней. Когда готовы приступить, используйте аспиратор, чтобы удалить дополненный DMEM и добавить три-пять миллилитров PBS, который разогрет до 37 градусов по Цельсию, чтобы мыть клетки. Используя аспиратор, удалите все PBS из колбы.Добавьте 1,5 миллилитров трипсина, который разогревается при 37 градусах Цельсия. Инкубация в инкубаторе CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение по крайней мере одной-двух минут. После этого добавьте 3,5 миллилитров DMEM, содержащих 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин.Pipette вверх и вниз, чтобы смешать. Перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую центрифугу и центрифуга в 417 раз G в течение трех минут при комнатной температуре. Затем, аспирировать среды.Добавьте пять миллиметров свежего DMEM, содержащего 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин. А при необходимости используйте криоконсервативное решение, чтобы криопресервирование клеток, как это предусмотрено инструкциями производителя. Первая смесь 10 миллилитров DMEM дополнена 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин с 0,8 грамма Декстрана, чтобы подготовить 80 миллиграмм на миллилитр Dextran раствор.Смешайте 200 микролитров этого раствора Dextran с 200 микролитров ранее подготовленной клеточной подвески, чтобы создать клеточную подвеску, содержащую 40 миллиграммов на миллилитр Dextran среды. Для начала включите лазер, обратите внимание, что использование лазерного луча с длиной волны в красном и ближнем инфракрасном регионе является наиболее эффективным. Затем откройте программное обеспечение, дважды нажав значок программного обеспечения.Дважды нажмите значок для камеры и обратите внимание, что соответствующий дисплей будет всплывающее. Затем дважды нажмите на значки для света, излучающего диод, регулировка фокуса и движущийся этап, чтобы открыть свои дисплеи, а также. Первое место два стеклянных проемов на нижней крышке стекла слайд.Перенесите 20 микролитров, предварительно подготовленный Dextran дополнил подвеску клетки на нижнюю крышку стеклянной горки. Затем поместите верхнюю крышку стеклянной горки на спейсеры, покрывающие подвеску ячейки. Поместите выборку ячейки на нижнюю объективную линзу с 10 микролитров дистиллированной воды для микроскопии погружения в воду.Прикрепите верхнюю объектив в верхней части выборочных клеток с помощью 10 микролитров дистиллированной воды. Затем нажмите кнопку выключать в окне освещения микроскопа, чтобы включить светодиод. Нажмите на кнопки направления в окне объективного позиционирования, чтобы настроить расстояние между образцом и объективом нижней цели до тех пор, пока он не будет в фокусе.Установите интенсивность каждого лазерного луча до 1500 милливатт в окне затухания сигнала. Затем нажмите на две лазерные иконки, чтобы облучить лазерные лучи в положении один и положение два. Нажмите на кнопки направления в окне позиционирования образца, чтобы переместить этап выборки до тех пор, пока ячейка не будет поймана в ловушку в первом положении.Нажмите и перетащите курсор, указывающий на положение два, пока другая ячейка не будет поймана в ловушку на второй позиции. Для начала манипулируйте одной ячейкой, чтобы она контактировать с другой ячейкой. Поддерживайте это условие в течение 300 секунд, так что клетка подвергается воздействию лазера в течение 300 секунд.Запись x-y-оси. Ловушка другой ячейки и транспортировать его в первые две ячейки, чтобы построить произвольные 2D сборки ячейки. Затем переместив сцену вверх и вниз, чтобы построить 3D сотовую сборку.Подтвердите, что сборка по-прежнему стабильна даже после того, как лазер выключен. В этом исследовании растворимые полимеры используются при строительстве 3D одноклеточных сборок. Здесь показана примерная структура, сформированная с использованием двухлучевой оптической пинцеты.Если эксперимент будет успешным, эти клеточные сборки остаются стабильными даже после того, как лазер выключен. Эта новая методология для строительства 3D клеточных сборок в aqueous среде с натуральным гидрофильным полимером. Ожидается, что строительство таких клеточных агрегатов нового поколения начнется с помощью мощных инструментов в области регенеративной медицины и тканевой инженерии.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Точечная вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия для анализа молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Полисомное профилирование без градиентных строителей или систем фракционирования

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Измерения резонансного переноса энергии Фёрстера в живых растительных клетках

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Массочувствительное отслеживание частиц для характеристики мембраноассоциированной динамики макромолекул

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Самостоятельная сборка тактоидов микротрубочек

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Комплексный подход к анализу клеточных компонентов церебральных тромбов

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...