Name: manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

Författarna tackar Shu Hashimoto, Aoi Yoshida och Taeko Ohta vid Doshisha universitet för deras generösa hjälp med experimentella setup. Detta arbete stöddes av KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) och av programmet MEXT-Supported för Stiftelsen för strategisk forskning vid privata universitet. Denna studie stöddes också av en polsk bidrag från KNOW (ledande nationella forskningscentret) vetenskapliga konsortiet ”friska djur – säker mat”, beslut av ministeriet för vetenskap och högre utbildning nr 05-1-KNOW2-2015...

1. beredning av celler
<ol><li>Upprätthålla NAMRU mus bröstkörteln epitelceller (NMuMG celler) med 5 mL av D-MEM innehållande 10% (v) fetalt bovint serum (FBS) och 1 procent (v) Penicillin-Streptomycin (P/S) i en 25 cm3 kolv. Ta bort Dulbecco's modified örnens medium (D-MEM), som innehåller 10% FBS och 1% P/S.</li>
	<li>Lägga till 3-5 mL 37 ° C fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (-) i kolven. Observera att pH-värdet i PBS är 7.1-7.3.</li>
	<li>Ta bort alla PBS från kolven med en insugningsventil.</li>
	<li>Tillsätt 1,5 mL 37 ° C trypsin (0,25%, w/v) till kolven.</li>
	<li>Inkubera kolven i cirka 1-2 minuter vid 37 ° C i en CO2 inkubator.</li>
	<li>Tillsätt 3,5 mL D-MEM som innehåller 10% FBS och 1% P/S till kolven. Pipetten att blanda.</li>
	<li>Överföra cellsuspensionen till en 15 mL centrifugrör och centrifugera det i 3 min i rumstemperatur. Observera att rotation radien och rotationshastigheten i centrifugen är 16,6 cm 1500 rpm, respektive. Under detta tillstånd är den relativ centrifugalkraften 417 x g.</li>
	<li>Tillsätt 5 mL färsk D-MEM (10% FBS och 1% P/S) till kolven efter aspirera medium (om så krävs, frysa cellerna med frysförvaring lösning, efter tillverkarens anvisningar).</li>
</ol>2. beredning av Dextran (DEX)
<ol><li>Bereda 80 mg/mL DEX lösning genom att blanda 10 mL av D-MEM (10% FBS, 1%P/S) och 0,8 g DEX. Observera att DEX lösningen kan filtreras med en spruta filter (0,22 µm) efter cellerna har odlade för tillräckligt lång tid.</li>
	<li>Förbered en cellsuspension som innehåller 40 mg/mL DEX medium genom att blanda 200 µL DEX lösning och 200 µL cellsuspension beredd i 2.1. Observera att den numrera tätheten av celler i lösningen är cirka 2,3 × 105 celler/mL.</li>
</ol>3. förberedelser för Laser och mikroskopi
<ol><li>Slå på lasern (kontinuerlig våg, 1 064 nm våglängd) (figur 1en). Observera att användning av en laserstråle med en våglängd i röd till infrarött region är mest effektiva; denna våglängd kallas de diagnostiska och terapeutiska fönster10 eftersom det absorberas minimalt av celler.</li>
	<li>Dubbelklicka på ikonen för programvaran.</li>
	<li>Dubbelklicka på ikonerna för ① kamera, ② lysdiod (LED), ③ fokus justera och ④ flyttar scenen. Motsvarar ①-④ displayen visar upp (figur 1b).</li>
</ol>4. cell Manipulation med hjälp av svällning
<ol><li>Placera 20 µL av de prov som bereddes i steg 2.2 på botten täckglaset (0.17 mm tjocklek, storlek = 30 mm × 40 mm), och täck den med översta täckglaset (0.17 mm tjocklek, storlek = 18 mm × 18 mm), med separation som tillhandahålls av två distanser (0.17 mm tjocklek storlek = 10 mm × 24 mm), som visas i figur 2. Observera att dessa glasögon inte kräver en speciell beläggning.</li>
	<li>Placera provet cellen bereddes i steg 4.1 på det lägre objektivet (vatten nedsänkning med ca. 10 μl, förstoring = 60 X, arbetsavstånd = 0,28 mm, numerisk bländare = 1,2)).</li>
	<li>Fäst det övre objektivet (vatten nedsänkning med ca. 10 μl, förstoring = 60 X, arbetsavstånd = 2 mm, numerisk bländare = 1,0) överst i cellen provet.</li>
	<li>Slå på LED ljus genom att klicka på ikonen 2 (figur 1b).</li>
	<li>Justera avståndet mellan provet och det lägre objektivet genom att klicka på ikonerna på panelen 3 (figur 1b) tills den är i fokus.</li>
	<li>Bestråla laserstrålar på läge 1 och läge 2 (figur 1B) av provet genom att klicka på ikoner I, II och III (figur 1b).</li>
	<li>Ange intensiteten i varje laserstrålen till 1 500 mW genom att ange detta värde på ikonen IV (figur 1b).</li>
	<li>Flytta provet scenen genom att klicka på ikonen 4 indikerande riktningar (figur 1b) tills en cell är fångade på Position 1 (figur 1b).</li>
	<li>Dra markören som anger Position 2 (figur 1b) till en annan cell är fångade på Position 2.</li>
</ol>5. byggande av en 3-dimensionell (3D) cellstruktur
<ol><li>Manipulera en cell så att den är i kontakt med en annan cell. Upprätthålla detta villkor för 300 s; dvs varje cell utsätts för en laser för 300 s.</li>
	<li>Spela in X-Y-axeln visas i figur 1b.</li>
	<li>Konstruera en godtycklig 2D cell församling genom svällning och transportera en annan cell till cellerna.</li>
	<li>Konstruera en 3D cellulära församling genom att flytta scenen upp och ner.</li>
	<li>Bekräfta att församlingen förblir stabilt efter lasern är avstängd.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold:+an+in+vitro+study.">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers.">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577 (2015).</li><li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel.">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li><li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation.">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li><li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells.">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li><li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+heterotypic+spheroid+model+for+studying+extracellular+vesicle-mediated+tumor+and+immune+cell+communication.">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+living+cells+to+construct+a+3D+single-cell+assembly+without+an+artificial+scaffold.">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319 (2017).</li><li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photothermolysis:+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation.">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li><li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Stable+Cell-Cell+Contact+without+a+Solid/Gel+Scaffold:+Non-invasive+Manipulation+by+Laser+under+Depletion+Interaction+with+a+Polymer.">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li><li>Rauch, P., J&#228;hnke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Tweezers+for+Quantitative+Force+Measurements+and+Live+Cell+Experiments.">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li><li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilt+control+in+optical+tweezers.">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Den aktuella studien visar en konkret tillämpning av våra senaste rapporter9,11 på användning av vattenlösliga polymerer för byggandet av 3D encelliga församlingar. Sådana sammansättningar bildas stabilt i bulk lösningen när antalet celler är upp till 10 och kan hållas av en enda laserstråle. Församlingar fällningen på glasytan när det finns mer än 10 celler. Även om experimenten är fortfarande i en primitiv fas, vi förväntar oss att den nya metoden kan vara ett kraftfullt verktyg för konstruktion av nästa generations 3D encelliga församlingar, som är oundgängliga för framsteg i fälten cellbiologi och regenerativ medicin.
En lösning innehållande någon polymer, celler stöter ifrån varandra på grund av den elektrostatisk repulsion uppkommer ytladdning, återfuktning repulsion kraft, glykokalyx repulsion effekt och membran vågformigheten. Vår tidigare studie visade att cellen par kan vara stabila under en lång tid när cellerna behandlas med PEG. Viktigare, antyder framgångsrika transport av en cell par till en region utan PEG, efter cellerna hade hållits i kontakt i 5 minuter i PEG, att cellulära kontakt upprätthålls på ett stabilt sätt. Detta är väl förklaras i termer av utarmning effekt11, och i huvudsak samma mekanism gäller de cellulära församlingarna som genererats med DEX9. Vår nuvarande resultaten tyder på att andra typer av naturliga makromolekyler också kunde användas att bygga stabila 3D cellulära församlingar.
För snabb transport av celler är koncentrationen av polymer viktigt. Generellt ökar viskositeten hos lösningen drastiskt när polymeren löses koncentration på överlappningen. Under detta tillstånd är det svårt att manipulera celler med hjälp av optisk pincett. Experimentet bör därför utföras under den överlappning koncentrationen. En DEX lösning, överlappning koncentrationen är ca. 50 mg/mL (kinetic viskositeten är 5,5 mm2/s). Som visas i Ref. 9, observerades en stabil cellulära församling när koncentrationen av DEX var 10 mg/mL till 40 mg/mL. Detta resultat tyder på att Uttunningen är tillräckligt stor för att upprätthålla stabila cell-cell kontakt även när DEX koncentrationen är lägre än den överlappning. Det har visats att tillägg av DEX inte påverkar cellernas viabilitet upp till 40 mg/mL 9.
Inrättandet av en metod för byggande av 3D cellulära församlingar är viktigt inom regenerativ medicin, sedan härma en i vivo cellulära närmiljön genom att strukturera enstaka celler kan underlätta stamceller-derived vävnad bildning. Hittills har vi använt detta protokoll för att konstruera cellulära sammansättningar med Neuro2A celler9 förutom NMuMG celler. Vi hoppas att etablera en experimentell metod för att konstruera 3D cellulära sammansättningar av ett större antal celler av olika morfologier. Optisk pincett systemet har utvecklats av Ichikawa o.a. 13 skulle vara tillämplig för detta ändamål eftersom inriktningen av cellerna kan styras. Ytterligare prövningar längs dessa linjer bör vara lovande.

Medan mänskliga vävnader består av flera aggregat av celler och kan bidra till att upprätthålla homeostas i kroppen, spela enstaka celler själva också viktiga roller via cell-till-cell interaktioner. Det är därför viktigt att belysa hur enstaka celler kan stimuleras av yttre signaler och hur de överföra sådana signaler till andra fastsittande celler. För detta ändamål, har flera metoder fastställts för byggandet av single-cell-baserad 3-dimensionell (3D)-sammansättningar1,2,3,4,5,6 ,7,8. De material som används för att konstruera cellulära församlingar kan dock fortfarande förbättras. Till exempel syntetiska geler och polymerer inklusive polyetylenglykol (PEG) besitter vissa kemiska fysikalisk-kemiska egenskaper och kan påverka målcellerna (t.ex. toxicitet).
Vi rapporterade nyligen ett nytt system som kan generera en single-cell-baserat 3D montering av celler använder dextran (DEX) genom att upprätta stabila cell-cell kontakt9. Vi ansåg att denna teknik kan vara användbar inom flera forskningsområden, bland annat regenerativ medicin och även cancerbiologi. I den här rapporten beskriver vi hur vi manipulera enstaka celler och konstruera 3-dimensionell (3D) cellulär församlingar i närvaro av olika hydrofil biomakromolekyler inklusive DEX utan en konstgjord byggnadsställning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Microscope IX71</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">IX71</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Dextran(200,000; molecular biology-grade)</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">CAS.NO&#160; 9004-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Laser Trapping System (NanoTracker 2)</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">S/N T-05-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Upper Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">LUMPLFLN60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lower Objective Lens</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">UPLSAPO60XW</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Top Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C022401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Intermediate Cover Glass (Spacer)</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td>custom-made (size = 10mm&#215;10mm, thickness = 0.17mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Bottom Cover Glass</td>
			<td style="width:124px;">MATUNAMI</td>
			<td style="width:136px;">C030401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Camera</td>
			<td style="width:124px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:136px;">DFK 31AF03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Software</td>
			<td style="width:124px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:136px;">NanoTracker2 PFM software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NMuMG cells&#160;</td>
			<td style="width:124px;">RIKEN BRC</td>
			<td style="width:136px;">RCB2868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PBS</td>
			<td style="width:124px;">Wako</td>
			<td style="width:136px;">166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Cell banker</td>
			<td style="width:124px;">Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td style="width:136px;">ZR621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">D-MEM</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:279px;">FBS</td>
			<td style="width:124px;">Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td>
			<td style="width:136px;">172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Trypsin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:124px;">Wako Pure Chem. Ind., Japan</td>
			<td style="width:136px;">161-23181</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating living cells to construct stable 3d cellular assembly without artificial scaffold

Regenerativ medicin och vävnadsteknik erbjuder flera fördelar för behandling av svårbehandlade sjukdomar, och flera studier har visat vikten av 3-dimensionell (3D) cellulär församlingar inom dessa områden. Konstgjorda byggnadsställningar har ofta använts för att konstruera 3D cellulära församlingar. Dock de ställningar som används för att konstruera cellulära församlingar är ibland giftiga och kan ändra egenskaperna för cellerna. Således skulle det vara fördelaktigt att upprätta en giftfri metod för att underlätta cell cell kontakt. I detta papper introducerar vi en ny metod för att bygga stabila cellulära sammansättningar med optisk pincett med dextran. En av fördelarna med denna metod är att det fastställer stabil cell till cell kontakt inom några minuter. Denna nya metod tillåter byggandet av 3D cellulära församlingar i en naturligt hydrofil polymer och förväntas vara användbar för att bygga nästa generations 3D encelliga församlingar inom regenerativ medicin och tissue engineering.

Figur 1 visar den Mikroskop och programvara som används i denna studie. Figur 2 är en schematisk representation av förfarandet för att placera provlösningen som innehåller celler. Figur 3 visar bildandet av en pyramidstruktur med dubbel-beam optisk pincett. Om försöket lyckas förblir dessa cellulära församlingar stabila även efter lasern är avstängd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> Figur 1 : (a) kontrollsystemet för Lasersystemet och svällning (NanoTracker2 (11)). Systemet aktiveras genom att vrida på växeln laser följande steg ①-③. (b) programvaran för att styra Lasersystemet och svällning. Kameran, LED ljus, fokus justera och flytta scenen aktiveras genom att klicka på ikoner ① ②, ③ och ④, respektive. Mikroskopiska bilden visas i panelen 1. På/av kontroll för att lampan är i panelen 2. Fokus är kontrollerad i panelen 3. Laserstrålar bestrålas på positioner 1 och 2 genom att klicka på ikoner I-IV. Detaljerna i denna Laser svällning Systemare föreskrivs i Ref. (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> Figur 2: representativa Principschema för att placera bilden glaset. 20 µL av provet (cellsuspension innehållande dextran) placeras i bilden och används för laser manipulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> Figur 3 : en) sammansättningar av epitelceller (NMuMG) avsedda formen i ett medium med DEX (40 mg/mL): en pyramid visas som ett exempel på ett 3D-kluster. b) en schematisk figur pyramid-formad 3D cellulära församlingens visas också. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold at JoVE.com

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Vi visar en ny metod för att konstruera en single-cell-baserad 3-dimensionell (3D) församling utan en konstgjord byggnadsställning.

Manipulera levande celler att bygga stabila 3D cellulära montering utan konstgjorda byggnadsställning

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Denna nya metodik gör det möjligt för oss att konstruera tredimensionella sammansättningar, anpassade från önskade enskilda celler, i en vattenlösning som innehåller ospecifik hydrofil polymer, genom att etablera stabil cell-cell kontakt. I den här videon kommer vi att demonstrera hur vi manipulerar önskade enstaka celler och konstruerar 3D-cellulära sammansättningar utan konstgjord byggnadsställning. Här kommer vi att visa det experimentella förfarandet i vårt medium med Dextran som exempel.Till att börja med, underhålla NAMRU mus bröstkörtels epitelceller med fem milliliter DMEM, som innehåller 10%FBS och 1%Penicillin-Streptomycin, i en 25 kubikcentimeter kolv för två till tre dagar. När du är redo att fortsätta, använd en aspirator för att ta bort den kompletterade DMEM och tillsätt tre till fem milliliter PBS, som är förvärmd till 37 grader Celsius för att tvätta cellerna. Ta bort alla PBS från kolven med hjälp av en aspirator.Tillsätt 1,5 milliliter trypsin som förvärms vid 37 grader Celsius. Inkubera i en CO2-inkubator vid 37 grader Celsius i minst en till två minuter. Efter detta, tillsätt 3,5 milliliter DMEM innehållande 10%FBS och 1%Penicillin-Streptomycin.Pipett upp och ner för att blanda. Överför cellupphängningen till ett 15 milliliter centrifugeringsrör och centrifug det vid 417 gånger G i tre minuter vid rumstemperatur. Därefter aspirera mediet.Tillsätt fem millimeter färsk DMEM innehållande 10%FBS och 1%Penicillin-Streptomycin. Och om det behövs, använd en cryopreservation lösning för att cryopreserve cellerna som beskrivs av tillverkarens instruktioner. Först blanda 10 milliliter av DMEM kompletteras med 10%FBS och 1%Penicillin-Streptomycin med 0.8 gram Av Dextran, att förbereda en 80 milligram per milliliter Dextran lösning.Blanda 200 mikroliter av denna Dextran-lösning med 200 mikroliter av den tidigare beredda cellupphängningen, för att skapa en cellfjädring som innehåller 40 milligram per milliliter Dextran-medium. Till att börja, slå på laser, observera att användningen av en laserstråle med en våglängd i den röda till nära infraröda regionen är mest effektiv. Nästa öppna programvaran genom att dubbelklicka på programikonen.Dubbelklicka på ikonen för kameran och observera att motsvarande display kommer att dyka upp. Dubbelklicka sedan på ikonerna för ljusavgivande diod, fokus justera, och den rörliga scenen för att öppna upp sina skärmar också. Första plats två glas distanser på botten täcka glas slide.Överför 20 mikroliter, den tidigare beredda Dextran kompletterad cellupphängning på undersidan täcka glas slide. Placera sedan den övre täckglaset på distanserna som täcker cellupphängningen. Placera provcellen på den nedre objektivlinsen med 10 mikroliter av destillerat vatten för vattendobadmikroskopi.Fäst den övre objektivlinsen längst upp i provcellen med hjälp av 10 mikroliter av destillerat vatten. Klicka därefter på on-off-knappen i mikroskopets belysningsfönster för att slå på lysdioden. Klicka på riktningsknapparna i målpositioneringsfönstret för att justera avståndet mellan provet och den lägre objektivet tills den är i fokus.Ställ in intensiteten för varje laserstråle på 1500 milliwatt i signaldämpningsfönstret. Klicka sedan på de två laserikonerna för att bestråla laserstrålarna vid position ett och position två. Klicka på riktningsknapparna i provet positioneringsfönstret för att flytta provstadiet tills en cell är instängd vid position ett.Klicka och dra markören som anger position två tills en annan cell är instängd vid position två. Till att börja med manipulera en enda cell, så att den är i kontakt med en annan cell. Underhåll detta villkor i 300 sekunder, så att cellen utsätts för en laser i 300 sekunder.Spela in x-y-axeln. Trap annan cell och transportera den till de första två cellerna för att konstruera en godtycklig 2D-cell montering. Flytta sedan scenen uppåt och nedåt för att konstruera en 3D-cellulär montering.Bekräfta att monteringen fortfarande är stabil även efter att lasern är avstängd. I denna studie lösliga polymerer används i byggandet av 3D enda cell församlingar. Här visas en exempelstruktur som bildas med hjälp av den optiska pincetten med dubbelstrålar.Om experimentet lyckas förblir dessa cellulära sammansättningar stabila även efter att lasern är avstängd. Denna nya metod är för byggandet av 3D cellulära församlingar i ett vattenhaltigt medium med naturliga hydrofil polymer. Det är mycket förväntas att starta byggandet av sådan typ av nästa generations cellulära församlingar med några av de kraftfulla verktyg inom regenerativ medicin och vävnadsteknik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi för analys av molekylär diffusion vid plasmamembranet i levande celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomprofilering utan övertoningstillverkare eller fraktioneringssystem

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonance Energy Transfer Mätningar i levande växtceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Masskänslig partikelspårning för att karakterisera membranassocierad makromolekyldynamik

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Självmontering av mikrotubulitaptoider

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Rekonstituering av septinmontering vid membran för att studera biofysiska egenskaper och funktioner

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Ett omfattande tillvägagångssätt för att analysera cellkomponenterna i cerebrala blodproppar

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...