Name: a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates
Uploaded: 2018-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates at JoVE.com

المعاهد الوطنية للصحة لتمويل الماضية وذلك بفضل مقدم البلاغ وذلك بفضل مايكل ر الأخضر لتوليف النوكليوتيد.

ملاحظة: الشكل 1 يوفر لمحة عامة عن الطفرات فوسفوروثيواتي ويوجز الخطوات الرئيسية في هذه العملية.
1-إنشاء مكتبة لطفرات – المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات-نوع البرية
<ol><li>توليف T7 التمهيدي (-جتاتاكجاكتكاكتاتاج 5 '-3') بالتوليف الكيميائي على المزج الحم?...

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins.">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520 (2007).</li><li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo.">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li><li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology.">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li><li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila.">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li><li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells:+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination.">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li><li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B.">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary.">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis.">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal.">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li><li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection.">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li><li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA.">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li><li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry.">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li></ol>

الطفرات منذ فترة طويلة تستخدم لوصف مواقع ربط بروتين. أولاً، يمكن تبني سلسلة من طفرات واختبار فردي في ملزمة فحوصات لتحليل آثارها على ملزمة تقارب. بينما يقدم نهجاً الطفرات قياسية طريقة لتحليل عدة سلاسل، خطوات متعددة تشترك في نهج قياسية، مثل تشييد طفرات وأداء سلسلة ملزما ردود الفعل لكل متحو?...

تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في مجال البيولوجيا. الجينات يمكن أن تنظم على مستوى النسخ، مرناً قبل الربط، 3 ' تشكيل نهاية، تصدير الجيش الملكي النيبالي، والترجمة، التعريب مرناً، تسوس، بوستترانسلاشونال التعديل/الاستقرار، إلخ كلا البروتينات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الملزمة تلعب أدواراً رئيسية في الجينات التنظيم. بينما حددت التحليلات الجينية الجزيئية البروتينات التنظيمية العديدة، اتسمت فقط مجموعة فرعية صغيرة من لهم تماما للوظائف الخلوية أو ربط المواقع في فيفو. تحليل تسلسل النشوء والتطور والطفرات نقدم نهج تكميلية لوصف التفاعلات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي البروتين.
الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات هامة في العمليات الإنمائية، بما في ذلك التمييز الجنسي. البروتين المورفولوجية الجنس الفتاكة (SXL) أو البروتين الرئيسي تبديل الجنس غائبا في الذكور، ولكن الوقت الحالي في الإناث. أنه يعترف بتسلسل الغنية uridine أو بيريميدين-مساحات المتاخمة لمواقع الوصلة المحددة في أهداف مرناً قبل المصب (المحولاتو الجنس الفتاكة، و lethal2 الخاصة بالذكور) في الخلايا الجسدية1،2 ،،من34. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه ينظم الموقع بوليادينيليشن التبديل بواسطة الربط إلى تسلسل محسن بوليادينيليشن الغنية أردين في5،نص محسن من بدائية (e(r))6. SXL المحتمل ينظم أهداف إضافية في germline الإناث التي لا يزال يتعين تحديد1،،من78،،من910،11، 12 , 13.
عادة، يشمل توصيف موقع الربط الطفرات، على سبيل المثال، بحذف أو استبدال واحد أو متعددة النيوكليوتيدات. كل موقع ملزم المسخ، بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي البرية من نوع، ثم يتم تحليل استخدام سلسلة من تركيزات البروتين لتحديد ما تقارب ملزم (الانفصالكد أو التوازن المستمر) لبروتين الاهتمام؛ كد هو تركيز البروتين اللازم للحصول على ربط الحمض النووي الريبي 50%. تتضمن هذه العملية ذات العمالة الكثيفة للطفرات مفصلة توليد وتحليل لطفرات عديدة – ثلاثة النيوكليوتيدات-نوع البرية لكل وظيفة في موقع الربط. وبالتالي، هناك حاجة إلى نهج بديل للطفرات تشبع أسرع وأبسط، وغير مكلفة لمواقع ربط بروتين في الجيش الملكي النيبالي.
وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore&#160;25&#160;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dephosphorlyation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في التنمية. ربط العديد الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات على تسلسلات الهدف مع خصوصية عالية للتحكم في التعبير الجيني. هذه البروتينات التنظيمية التحكم في التعبير الجيني أما على مستوى الحمض النووي (النسخ) أو على مستوى الحمض النووي الريبي (الربط مرناً قبل بوليادينيليشن، ومرناً، والانحلال والنقل والترجمة). تحديد تسلسل تنظيمي يساعد على فهم ليس فقط كيف يتم تبديل جين أو إيقاف تشغيله، ولكن أيضا الجينات المصب التي ينظمها بروتين تنظيمية خاصة. وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

مبدأ الطفرات التشبع باستخدام المنشطات:
لنسبة مولى مناسبة البرية من نوع وغيرها النيوكليوتيدات، استخدم خليط متساو من النيوكليوتيدات الأربعة جميع إلا إذا كان موقف واحد يتم تحليلها. ومع ذلك، إذا كان يتم تحليل مواقف متعددة في نفس الوقت، يجب تع...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates at JoVE.com

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

البروتينات التي تربط تسلسل معين من الحمض النووي الريبي تلعب أدواراً حاسمة في التعبير الجيني. وصف مفصل لمواقع الربط هذه الأهمية الحاسمة لفهمنا لتنظيم الجينات. ويرد هنا، اتباع نهج خطوة واحدة للطفرات تشبع مواقع ربط البروتين في الجيش الملكي النيبالي. وهذا النهج ذات الصلة لجميع مواقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...