Name: a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates
Uploaded: 2018-08-21T14:00:00
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저자는 건강의 국가 학회는 지난 자금에 대 한 감사 위한 그리고 감사 마이클 R. 그린 oligonucleotides 합성.

참고: 그림 1 phosphorothioate mutagenesis에 대 한 개요를 제공 하 고 프로세스의 주요 단계를 요약.
1. 돌연변이 체의 도서관의 세대-야생 타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑
<ol><li>T7 뇌관 종합 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') 화학 합성 DNA 합성기에 의해.</li>
	<li>화학 합성 단백질 바인딩 사이트에 해당 하는 DNA 합성기에 의해도 핑된 oligonucleotide (보완 가닥) 음성 합?...

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins.">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520 (2007).</li><li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo.">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li><li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology.">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li><li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila.">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li><li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells:+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination.">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li><li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B.">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary.">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis.">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal.">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li><li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection.">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li><li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA.">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li><li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry.">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li></ol>

Mutagenesis은 긴 단백질 바인딩 사이트 특성에 사용 되었습니다. 첫째, 돌연변이의 시리즈 구성 하 고 바인딩 바인딩 선호도에 미치는 영향을 분석 하는 분석에서 개별적으로 테스트 될 수 있습니다. 기준이 mutagenesis 접근 여러 시퀀스를 분석 하는 방법을 제공 하는 동안 여러 단계 돌연변이 구성 하 고 바인딩 각 돌연변이 대 한 반응의 일련과 같은 표준 접근에, 힘들고 시간이 걸리는 이며 하지 않을...

유전자 규칙 생물학에 있는 중요 한 역할을 한다. 유전자의 전사 사전 mRNA 접합, 3' 끝, RNA 수출, 번역, mRNA 지 방화, 붕괴, 포스트 번역 상 수정/안정성, 등 모두 DNA과 RNA 의무적인 단백질 유전자에 핵심 역할 수준에서 통제 될 수 있다 규칙입니다. 수많은 규제 단백질 식별 분자 유전 분석, 하는 동안 그들의 작은 하위 집합만 그들의 세포질 기능 또는 바인딩 사이트 비보완전히 특징 되어 있다. 계통 발생 시퀀스 분석과 mutagenesis DNA 또는 RNA 단백질 상호 작용의 특성을 상호 보완적인 접근을 제공 합니다.
RNA-바인딩 단백질은 성적인 감 별 법을 포함 하 여 개발 프로세스에서 중요 한. 섹스-치명적인 (SXL) 초파리 단백질 또는 마스터 섹스-스위치 단백질은 결 석 남성, 여성에서 현재에. Uridine-풍부한 시퀀스 또는 pyrimidine 책자 다운스트림 사전 mRNA 목표 (변압기, 치명적이 지 섹스, 남성 전용 lethal2) 체세포1,2에서에서 특정 스플라이스 사이트에 인접 한 인식 ,,34. 또한, 그것은 기초의 증강 (e(r)) 사본5,6uridine 풍부한 polyadenylation 증강 시퀀스에 바인딩하여 스위칭 polyadenylation 사이트 조절. SXL 가능성이 조절 되도록 남아 있는 여성 생식에 추가 대상 확인1,7,,89,,1011, 12 , 13.
일반적으로, 바인딩 사이트의 특성을 포함 한다 mutagenesis를, 예를 들어 삭제 또는 단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드의 대체. 야생-타입 RNA 순서를 기준으로 각 돌연변이 바인딩 사이트 다음 바인딩 선호도 결정 하기 위해 일련의 단백질 농도 사용 하 여 분석 (Kd 또는 평형 분리 상수); 관심사의 단백질에 대 한 Kd 50 %RNA 바인딩을 얻을 하는 데 필요한 단백질 농도 이다. 자세한 mutagenesis의이 노동 집약적인 과정 포함 세대 및 수많은 돌연변이의 분석-3 야생 타입 뉴클레오티드 바인딩 사이트에 있는 각 위치에 대 한. 따라서, RNA에 단백질 의무 사이트의 빠르고, 쉽고, 저렴 한 포화 mutagenesis에 대 한 다른 접근 방법에 대 한 필요가 있다.
여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore&#160;25&#160;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dephosphorlyation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

유전자 규칙 개발에 중요 한 역할을 한다. 수많은 DNA과 RNA 의무적인 단백질 높은 특이성 유전자 발현 제어를 가진 그들의 대상 시퀀스를 바인딩합니다. 이러한 규제 단백질 유전자 발현 DNA (전사)의 수준에서 또는 RNA (이전 mRNA 접합, polyadenylation, mRNA 전송, 부패, 및 번역)의 수준에서 제어합니다. 식별 규제 시퀀스의 유전자가 켜거나 전환 뿐만 아니라 또한 어떤 다운스트림 유전자 규정 하는 특정 단백질에 의해 통제 된다 이해 하는 데 도움이 됩니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

도 핑을 사용 하 여 포화 mutagenesis의 원리:
야생-타입 및 다른 뉴클레오티드의 적절 한 어 금 니 비율을 분석 하는 것입니다 한 위치 하는 경우에 모든 4 개의 뉴클레오티드의 동등한 혼합물을 사용 합니다. 그러나, 그러므로 동시에 여러 위치를 분석 비율의 비-야생 타입 야생-타입 뉴클레오티드를 조정 해야 합니다, 즉, 감?...

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A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

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연구

유전학

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

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대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

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레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...