Name: a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates
Uploaded: 2018-08-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates at JoVE.com

Forfatteren Takk National Institutes of Health for siste finansiering og takk Michael R. Green for å syntetisere oligonucleotides.

Merk: Figur 1 gir en oversikt over phosphorothioate mutagenese og oppsummerer viktige trinn i prosessen.
1. generasjon av et bibliotek av mutanter-Doping DNA mal med wild Type nukleotider
<ol><li>Syntetisere T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3 ") av syntese i DNA synthesizer.</li>
	<li>Syntetisere en dopet oligonucleotide (komplementære strand) av syntese i DNA synthesizer tilsvarer protein binding området. Bruke en passende blanding av phosphoramidites under ...

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins.">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520 (2007).</li><li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo.">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li><li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology.">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li><li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila.">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li><li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells:+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination.">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li><li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B.">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary.">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis.">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal.">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li><li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection.">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li><li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA.">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li><li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry.">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li></ol>

Mutagenese har lenge vært brukt til å simulere protein bindende områder. Først kan en rekke mutanter, konstruert og testet individuelt i bindingen analyser analysere deres effekter på bindende affinitet. Mens en standard mutagenese tilnærming tilbyr en måte å analysere flere sekvenser, flere skritt involvert i standard tilnærming, som konstruere mutanter og utføre en rekke bindende reaksjoner for hver mutant, er arbeidskrevende og tidkrevende og ikke tillate metning mutagenese, spesielt for lengre sekvenser. An...

Genreguleringen spiller en viktig rolle i biologi. Gener kan reguleres på nivå med transkripsjon, pre-mRNA skjøting, 3 slutt dannelsen, RNA eksport, oversettelse, mRNA lokalisering, forfall, post-translasjonell modifikasjon/stabilitet, etc. begge DNA og RNA-bindende proteiner spiller nøkkelroller i genet regulering. Mens molekylær genetisk analyser har identifisert mange regulatoriske proteiner, bare en liten del av dem har vært preget fullt cellulære funksjoner eller bindende områder i vivo. Fylogenetiske sekvens analyse og mutagenese tilbyr supplerende tiltak for å karakterisere DNA eller RNA-protein interaksjoner.
RNA-bindende proteiner er viktige utviklingsprosesser, inkludert seksuell differensiering. Drosophila protein Sex-dødelige (SXL) eller sex-hovedbryter protein er fraværende i menn, men stede i kvinner. Den gjenkjenner uridine-rik sekvenser eller pyrimidine-traktater tilstøtende til bestemte skjøte områder i nedstrøms pre-mRNA mål (transformator, Sex-dødeligeog hann-spesifikk lethal2) i somatiske celler1,2 ,3,4. I tillegg regulerer den polyadenylation nettstedet bytte ved binding til uridine-rik polyadenylation enhancer sekvenser i enhancer av rudimentære (e(r)) transkripsjon5,6. SXL sannsynlig regulerer flere mål i den kvinnelige germline som gjenstår for å bli identifisert1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Vanligvis innebærer karakterisering av en bindende nettsted mutagenese, for eksempel ved sletting eller substitusjon av én eller flere nukleotider. Hvert område som mutant bindende, i forhold til vill-type RNA sekvensen, analyseres deretter bruke en serie med protein konsentrasjoner for å bestemme dens forpliktende tilhørighet (Kd eller likevekt dissosiasjon konstant) for protein steder. Kd er protein konsentrasjon nødvendig for å få 50% RNA bindende. Denne arbeidskrevende prosessen med detaljert mutagenese omfatter generasjon og analyse av mange mutanter-tre ikke-wild type nukleotider for hver posisjon i området bindende. Dermed er det behov for en alternativ tilnærming for raskere, enklere og rimelig metning mutagenese av protein bindende RNA.
Her beskriver vi en ett-trinns tilnærming som gjør at metning mutagenese av et protein bindende område i RNA. Det innebærer doping DNA mal med ikke-vill-type nukleotider på binding området, syntese av separate RNAs med hver phosphorothioate nucleotide og isolasjon av den bundne fraksjon etter inkubasjon med protein. Forstyrrelser fra ikke-vill-type nukleotider resulterer i deres fortrinnsrett utelukkelse fra protein-bundet brøken. Dette er kontrollert av gel geleelektroforese etter selektiv kjemiske spalting med jod phosphodiester obligasjoner som inneholder phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkeltsteg metning mutagenese gjelder karakterisering av alle protein bindende områder i RNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore&#160;25&#160;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dephosphorlyation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

Genreguleringen spiller en viktig rolle i utviklingen. Mange DNA og RNA-bindende proteiner binde sekvensene målet med høy spesifisitet kontrollere genuttrykk. Disse regulatoriske proteiner styre genuttrykk enten på nivået av DNA (transkripsjon) eller på nivået av RNA (pre-mRNA skjøting, polyadenylation, mRNA transport, forfall og oversettelse). Identifikasjon av regulatoriske sekvenser bidrar til å forstå ikke bare hvordan et gen er slått på eller av, men også hvilke nedstrøms gener er regulert av en bestemt regulatoriske protein. Her beskriver vi en ett-trinns tilnærming som gjør at metning mutagenese av et protein bindende område i RNA. Det innebærer doping DNA mal med ikke-vill-type nukleotider på binding området, syntese av separate RNAs med hver phosphorothioate nucleotide og isolasjon av den bundne fraksjon etter inkubasjon med protein. Forstyrrelser fra ikke-vill-type nukleotider resulterer i deres fortrinnsrett utelukkelse fra protein-bundet brøken. Dette er kontrollert av gel geleelektroforese etter selektiv kjemiske spalting med jod phosphodiester obligasjoner som inneholder phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkeltsteg metning mutagenese gjelder karakterisering av alle protein bindende områder i RNA.

Prinsippet om metning mutagenese bruker doping:
Bruke en lik blanding av alle fire nukleotider en passende molar ratio av vill-type og andre nukleotider, hvis bare en stilling som skal analyseres. Men hvis flere stillinger blir analysert samtidig, forholdet av ikke-wild type å vill-type nukleotider må justeres, dvs. redusert. Ellers i tillegg enkelt erstatninger, er ønsket, vil det også være maler med flere ikke-wild ...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates at JoVE.com

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Proteiner som binder bestemt RNA sekvenser spille viktige roller i genuttrykk. Detaljert karakterisering av disse bindende områder er avgjørende for vår forståelse av genet regulering. Her beskrives et enkeltsteg tilnærming for metning mutagenese av protein-bindende RNA. Denne tilnærmingen er relevant for alle protein-bindende områder i RNA.

En roman metning mutagenese tilnærming: Enkeltsteg karakteristikk av regulatoriske Protein bindende områder i RNA bruker Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel RNA-bindende proteiner Isolering av den raske Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; mutagenese av Histone Gener i Budding Gjær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral skanning: Mapping MLV Integrering Sites for å definere Cell-spesifikke Regulatory Regioner

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyser bruker OpenProt databasen å avsløre romanen proteiner oversatt fra ikke-kanoniske åpent lesing rammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...