Name: the replica set method: a high-throughput approach to quantitatively measure caenorhabditis elegans lifespan
Uploaded: 2018-06-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan at JoVE.com

Le financement de ces travaux décrit dans ce manuscrit a été fourni par : le Bureau de l’Université de Rochester de The Provost et de l’école de médecine et de dentisterie Décanat via le centre de Sciences de la santé pour l’Innovation informatique (HSCCI) ; la Ellison médicaux nouveaux boursiers de la Fondation en vieillissement Fellowship (AG-NS-0681-10) les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

1. traditionnelle méthode de Scoring c. elegans longévité
<ol><li>Préparation des réactifs
	<ol>
<li>Identifier les gènes à être inactivé par l’intermédiaire de RNAi axée sur l’alimentation. Achat de stocks transformées de HT115 e. coli2 contenant le clone de RNAi d’intérêt. Sinon, subclone l’ADNc du gène d’intérêt dans le site multicloning du plasmide L4440. Remarque : HT115 est une souche de RNase III-deficient Escherichia c...

<ol>
	<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA+[10].">Specific interference by ingested dsRNA [10].</a> Nature. 395 (6705), 854 (1998).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2000).</li><li>Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+SID-2+is+required+for+environmental+RNA+interference.">Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1.">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).</li><li>Grishok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+mechanisms+in+Caenorhabditis+elegans.">RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).</li><li>Ceron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Improving+Caenorhabditis+elegans+Phenome+Mapping+With+an+ORFeome-Based+RNAi+Library.">Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library.</a> Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes &amp; Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Petrascheck, M., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+Analysis+of+Lifespan+Experiment+Reproducibility.">Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility.</a> Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).</li><li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Caenorhabditis+elegans+Genes+Regulating+Longevity+Using+Enhanced+RNAi-sensitive+Strains.">Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).</li><li>. R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2018)</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).</li><li>Shi, C., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+Induces+Shrinking+and+Death+in+Caenorhabditis+Mothers.">Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers.</a> Science. 343 (6170), 536-540 (2014).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations.">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).</li><li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+survival+data+and+two+new+rank+order+statistics+arising+in+its+consideration.">Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration.</a> Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).</li><li>Rechavi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation-induced+transgenerational+inheritance+of+small+RNAs+in+C.+elegans.">Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans.</a> Cell. , (2014).</li><li>Larance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Proteomics+Analysis+of+the+Response+to+Starvation+in+C.+elegans.">Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).</li><li>Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Parameter+Logistic+and+Weibull+Equations+Provide+Better+Fits+to+Survival+Data+From+Isogenic+Populations+of+Caenorhabditis+elegans+in+Axenic+Culture+Than+Does+the+Gompertz+Model.">Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).</li><li>Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Myc-Mondo/Mad+Complexes+Integrate+Diverse+Longevity+Signals.">The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals.</a> PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).</li><li>Ogg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fork+head+transcription+factor+DAF-16+transduces+insulin-like+metabolic+and+longevity+signals+in+C.+elegans.">The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans.</a> Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).</li><li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+genes+tied+to+endocrine,+metabolic,+and+dietary+regulation+of+lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+genomic+RNAi+screen.">New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen.</a> PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PloS one. 9 (1), e85964 (2014).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+regulate+both+development+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).</li><li>Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+TGF-beta+Dauer+pathway+regulates+longevity+via+insulin+signaling.">The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling.</a> Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).</li><li>Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worming+pathways+to+and+from+DAF-16/FOXO.">Worming pathways to and from DAF-16/FOXO.</a> Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).</li><li>Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16:+An+HNF-3/forkhead+family+member+that+can+function+to+double+the+life-span+of+Caenorhabditis+elegans.">daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans.</a> Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).</li><li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+maintaining+large,+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).</li><li>Hosono, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterilization+and+growth+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+by+5-fluorodeoxyuridine.">Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine.</a> Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).</li><li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine.">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li><li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR,+base+excision+repair,+FOXO,+and+sirtuins.">C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).</li><li>Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li><li>Yu, S., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+signaling+comes+of+age:+Promotion+of+healthy+aging+in+C.+elegans.">EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).</li><li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormScan:+A+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans.">WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., L&#243;pez-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caenorhabditis+elegans+lifespan+machine.">The caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li></ol>

Les deux méthodes traditionnelles et replica set nécessitent la synchronisation des animaux âgés chronologiquement. Nous incluons une méthode qui synchronise les animaux à l’aide de traitement hypochlorite d’adultes gravides, où seulement des oeufs fécondés avec les adultes gravides survivent. Ces embryons éclosent en suspension liquide et développemental arrêtent au premier stade larvaire (L1). Après l’ensemencement L1 animaux sur les aliments (p. ex. e. coli exprimant dsRNA à un g?...

Une des avancées technologiques plus transformatrices dans la compréhension de la base génétique du vieillissement était le développement de l’alimentation-basé Arni dans c. elegans1; avant l’utilisation expérimentale de l’ARNi, nombreux phénotypes du vieillissement n’étaient pas génétiquement tractable. Arni axée sur l’alimentation est assurée par la production d’ARNdb dans e. coli qui correspond à un endogène ARNm c. elegans : IPTG induit la transcription bidirectionnelle à travers l’insertion de l’ADNc de c. elegans soit ou une partie d’un cadre de lecture ouvert dans un plasmide2. Lorsque c. elegans se nourrissent intact dsRNA d’e. coli, produite par les bactéries est transporté de la lumière dans les cellules intestinales par l’intermédiaire de la protéine transmembranaire de SID-23et ensuite distribué sur le reste de l’animal par l’intermédiaire de SID-14. Dans chaque cellule, dsRNA exogène est transformé par le complexe de Dicer en siRNA, qui interagissent avec un ARNm mature par appariement de base complémentaires pour créer un nouveau duplex siARN-ARNm. Ce duplex est reconnu par le complexe RISC et clivé, donc dégradation des ARNm endogène5. Ainsi, en changeant simplement l’insert de plasmide, on peut inactiver la fonction de presque n’importe quel gène dans le génome de c. elegans . Cette découverte a mené à la création de plusieurs grandes base alimentation RNAi-collections des bibliothèques de transforment les stocks d’e. coli qui peuvent être combinés pour obtenir une couverture d’environ 86 % de connue c. elegans gènes6, 7.
Depuis l’avancement de l’ARNi axée sur l’alimentation, les écrans complets chez c. elegans ont conduit à la découverte de plus de 900 gènes qui modifient la durée de vie lorsque inactivée (comme en témoignent les associations RNAi-phénotype organisées dans WormBase), que nous appelons à titre gerogenes. Un rôle pour la majorité des gerogenes dans le contrôle de la longévité a été découvert par ARNi axée sur l’alimentation dans quelques rapports séminales (voir Figure 1 a et 1 de fichier supplémentaire pour plus de détails). Dans certains cas, ces gerogenes ont été identifiés, basée sur la mesure de la viabilité à un seul ou quelques points dans le temps, qui ne parvient pas à fournir une mesure quantifiable de la variation de la durée de vie avec le traitement de l’ARNi. Dans d’autres cas, ces gènes ont été évaluées quantitativement des changements dans la durée de vie, ainsi que des phénotypes supplémentaires liés à l’âge. Par exemple, nous avons identifié précédemment 159 gènes qui ont été nécessaires pour la durée de vie normale et une augmentation des animaux avec une diminution de signalisation de l’insuline/IGF-1 et quantifier les changements healthspan. Parmi ceux-ci, 103 inactivations gènes entraîner un phénotype progeric, que le sinistre résulte en une ou plusieurs des signes de vieillissement prématuré,8.
Alors que certains gerogenes ont été associés à des études de 100 ou plus (p. ex. 16-daf, daf-2, sir-2.1), plus de 400 gerogenes ont des citations 10 ou moins (Figure 1 bet 2 fichier supplémentaire). Ainsi, alors que les écrans de RNAi globales axée sur l’alimentation ont découvert et caractérisé superficiellement des centaines de gerogenes putatif, comment la fonction de ces gènes dans contrôle de longévité et des liens génétiques entre les produits de ces gènes restent mal a étudié. Analyse complète longitudinale pour les phénotypes liés à l’âge est une condition sine qua non pour l’identification des interactions génétiques entre gerogenes (p. ex. les interactions épistatiques, asynthetic interactions, etc.). Se faire une idée plus profonde dans les relations génétiques entre gerogenes exige une méthode quantitative de haut débit, qui s’appuie également sur les avantages de l’ARNi axée sur l’alimentation.
La mesure de substitution plus courante du vieillissement est la durée de vie. L’approche traditionnelle pour la mesure de la mortalité de c. elegans suit la mort de chaque animal dans le temps au sein d’un échantillon de population réduite. Un nombre relativement restreint d’animaux est suivi au fil du temps et périodiquement est poussé doucement avec un fil de platine ou cils, avec le mouvement comme un indicateur de la viabilité (Figure 2 a). Cette méthode a été largement utilisée, comme il fournit des mesures simples et directes de la moyenne et la durée de vie maximale. Toutefois, cette méthode traditionnelle est fastidieuse et relativement faible débit, qui limite le nombre d’animaux et les conditions qui peuvent simultanément être mesurées de façon contrôlée. Une récente étude de simulation constaté que de nombreuses études de durée de vie de c. elegans doser pas un assez grand nombre d’animaux pour pouvoir détecter les petits changements entre conditions9de façon fiable. En outre, cette méthode traditionnelle consiste à manipuler à plusieurs reprises la même cohorte d’animaux au fil du temps, qui à son tour peut introduire de contamination et peut endommager ou tuer les animaux de plus en plus fragiles, âgé.
Nous avons développé une méthodologie alternative « jeu de réplicas » pour mesurer la durée de vie de c. elegans . À cette fin, une grande population d’isogéniques, synchronisé à l’âge des animaux sont divisés en un certain nombre de petites populations (ou répliques). Des échantillons assez réplique sont générés pour couvrir chaque instant dans l’expérience prévue. Chaque point de temps d’observation, un des réplicas est orchestré pour le nombre de morts vivants et animaux censuré, puis animaux au sein de cette duplication est ignorées. Ainsi, plus la durée de vie prévue de la population dans son ensemble, une série de sous-populations indépendantes sont régulièrement échantillonnées (Figure 2 b). En utilisant des jeux de réplicas il n’y a aucune insistance répétée des animaux et aucune exposition répétée à la contamination de l’environnementale. La viabilité a observé au point unique est totalement indépendante de toute autre observation, qui minimise la manipulation et augmente le débit d’au moins un ordre de grandeur. Cela nous a permis de quantifier les changements dans la durée de vie pour des centaines de RNAi clones simultanément8,10.
Nous présentons des protocoles détaillés pour la conduite de c. elegans durée de vie du jeu de réplicas et des méthodes traditionnelles pour la notation c. elegans longévité par. Nous démontrons que des résultats similaires sont obtenus entre les méthodes. Nous avons un logiciel développé pour aider à l’analyse graphique des données de durée de vie générées par le biais de deux approches, que nous fournissons gratuitement sous licence GPL V3 (voir le tableau des matériaux). « WormLife » est écrit en R11et inclut une interface utilisateur graphique (GUI) pour le traçage des données, ce qui a été testées sur Mac OS et Linux. Enfin, nous comparer et contraster les limites de chaque méthode et mettre en évidence d’autres considérations lors du choix entre les approches pour mesurer des changements quantitatifs dans la durée de vie de c. elegans .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td style="width:108px;">Gold Bio</td>
			<td style="width:119px;">12481C100</td>
			<td style="width:527px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td style="width:108px;">Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:367px;">24 Well Culture Plates</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td style="width:108px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">2mL 96-well plates</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Air-permeable plate seal</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">96-pin plate replicator</td>
			<td style="width:108px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">bacto-peptone</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">bacteriological agar</td>
			<td style="width:108px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:119px;">10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:367px;">C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td style="width:108px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:367px;">C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td style="width:108px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis</td>
			<td style="width:108px;">Samuelson Lab</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">L4440 Empty Vector Plasmid</td>
			<td style="width:108px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">1654</td>
			<td>https://www.addgene.org/1654/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Wormbase</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.wormbase.org/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">OASIS</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the replica set method: a high-throughput approach to quantitatively measure caenorhabditis elegans lifespan

La méthode de jeu de réplicas est une approche pour mesurer quantitativement la durée de vie ou la survie des nématodes Caenorhabditis elegans de manière haut débit, permettant ainsi un seul enquêteur cribler des traitements ou des conditions plus au cours de la même quantité de temps sans perte de qualité des données. La méthode nécessite des équipements communs trouvés dans la plupart des laboratoires travaillant avec c. elegans et est donc simple à adopter. L’approche se concentre sur titrage des échantillons indépendants d’une population à chaque point d’observation, plutôt que d’un seul échantillon au fil du temps comme avec les méthodes traditionnelles de longitudinales. Notation consiste à ajouter du liquide sur les puits d’une plaque multipuite, qui stimule c. elegans pour déplacer et facilite la quantification changements dans healthspan. Autres atouts majeurs de la méthode de jeu de réplicas comprennent la réduction de l’exposition de la surface des géloses de contaminants atmosphériques (p. ex. de moisissure ou champignon), un minimum de manipulation des animaux et la robustesse de sporadiques mal marquant (par exemple appeler un animal comme mort quand il est encore Alive). Pour bien analyser et visualiser les données d’une expérience de style de jeu de réplicas, a également été développé un outil de logiciel personnalisé. Les capacités actuelles du logiciel comprennent le tracé des courbes de survie pour le jeu de réplicas et des expériences traditionnelles (Kaplan-Meier), tant que l’analyse statistique pour le jeu de réplicas. Les protocoles fournis ici décrivent l’approche expérimentale traditionnelle et la méthode de jeu de réplicas, ainsi un aperçu de l’analyse de données correspondante.

Dans le développement d’une toute nouvelle méthodologie, il est impératif que la nouvelle méthode récapitule les résultats reconnus des approches précédentes et répond à la norme dans un champ. Nous avons déjà démontré empiriquement que les méthodes traditionnelles pour doser la durée de vie de c. elegans et jeu de réplicas produisent des résultats semblables20. Sauvage c. elegans (N2) maintenue à 20 ° C en général vivent e...

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The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Nous décrivons ici la méthode de jeu de réplicas, une approche quantitative mesure la durée de vie/survie de c. elegans et healthspan d’une manière robuste et haut débit, permettant ainsi la projection de nombreuses conditions sans sacrifier la qualité des données. Ce protocole décrit la stratégie et fournit un outil logiciel pour l’analyse des données de jeu de réplicas.

La méthode Set de la réplique : Une approche de haut-débit pour mesurer quantitativement Caenorhabditis elegans durée de vie

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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