Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for støtte fra det tyske Forbundsministerium for økonomi og energi inden for rammerne ZIM-Koop, projekt "Smart proces inspektion", Grant nej. ZF 4184201CR5.

Bemærk: følgende trin er nødvendige for at tilpasse parametrene til de respektive mikroorganismer og dyrkningsbetingelser. Justeringen af sonde indstillingerne varer ca. 20 min. for en erfaren bruger. En detaljeret beskrivelse af værktøjer og trin er angivet i den tilsvarende sonde manual fra SOPAT GmbH. Generelt er de værktøjer, der er præsenteret i følgende protokol er nødvendige: (i) Probe controller til sonde justeringer og image erhvervelse; (II) Fiji (ImageJ) for anmærkninger om erhverv...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM som præsenteret her med samme eller meget lignende enheder blev brugt til at måle morfologiske dynamik af svampe, mikroalger, og gærceller, som gjorde det muligt at fastsætte vækst aktivitet, og i tilfælde af alger, intracellulære produkt ophobning. Sensoren har ingen bevægelige dele og er direkte anvendelig i enhver standard rørbeholder bioreaktor, enten gennem en standard port eller i en steriliserbar by-pass. Da gær er meget mindre end alger, krævede reduktionen i Cellestørrelse nogle nylige hardware t...

Morfologiske funktioner i celler er ofte relateret til den fysiologiske tilstand, en forbindelse mellem form og funktion findes for mange applikationer. Morfologien af en enkelt celle påvirkes af vækst tilstanden, cellens alder, osmotiske og andre potentielle celle belastninger eller produkt akkumulering. Morfologiske ændringer af celler er ofte et mål for vækst vitalitet af en kultur. Intracellulære produkt syntese, lipid ophobning i alger og inklusion krop dannelse i bakterier, blandt andre, er relateret med Cellestørrelse samt. Celle agglomerering kan være en anden faktor, der er værd at undersøge som opsummeret for nylig2.
Populations heterogeniteter kan kvantificeres baseret på morfologiske træk ved individuelle celler. Undersøgelser viste, at heterogenitet inden for en kultur kan være signifikant, fxunder store produktionsforhold3 det samlede udbytte kan blive påvirket af en lav præstation af subpopulationer4.
Normalt udføres vurderingen af morfologiske træk af celler ved manuel prøvetagning eller med et by-pass flow kammer koblet til en foto-optisk enhed. Dette fører til flere begrænsninger: den begrænsede mængde af erhvervede data kan næppe give statistisk pålidelige målinger; tidsforsinkelsen mellem prøveudtagningen og tilgængeligheden af resultaterne kan være for lang i forhold til processens dynamik; og vigtigst er det, at prøvetagningsproceduren (placering af prøvetagnings havnen, forbehandling af prøven før målingen, ugunstige forhold i prøveudtagnings-eller bypass-røret) kan udløse en partisk fejl, da selve prøve proceduren allerede kan påvirke celle Morfologi. Endelig findes der altid en høj risiko for kontaminering under prøvetagning eller i ved-pass-løsninger, hvis de ikke er steriliserbare på plads.
Anvendelse af in situ -mikroskopi (ISM) kan omgå flere af disse problemer. Hvis celler registreres automatisk, kan en korrekt identifikation af deres morfologiske funktioner blive undersøgt5. Indtil nu var de vigtigste begrænsninger ved denne metode (i) evaluerings tiden for billeder, som var for lang til in situ -applikationer, og (II) den dårlige opløsning af billeder, især ved høje celle tætheder. Selv om de første løsninger af ISM omfattede mekanisk prøvetagning, fortynding af sonden, eller var begrænset til en by-pass-system6,7, yderligere tilgange tillader opsamling af cellesuspensionen direkte8.
Nylige fremskridt inden for ISM giver mulighed for i linje eller på linje overvågning af celler på en enkelt celle basis, som giver fordelingen af morfologiske parametre i realtid direkte i celle suspensioner ved betydeligt høje celle koncentrationer. Gennem off-line analyser af cellernes nøgleparametre kan korrelationer med oplysninger fra den koblede automatiserede celle detektering og ISM identificeres. Derefter opnås nye bløde sensor designs, hvor en umålelig parameter estimeres med en enkelt celle morfologi.
I denne rapport er ISM gennemført ved at koble en foto-optisk sonde til en automatiseret billedanalyse. ISM består af en enkelt-stang sensor sonde, der gør det muligt at fange billeder inden for et kendt fokusområde i en justerbar måle kløft med et højopløsnings-CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) og MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Blitzen lys belysning udføres ved transmission. Derfor stammer lyset fra den modsatte side af kameraet9 , og dets intensitet kan justeres. Cellerne passerer kontinuerligt gennem dette hul med væskestrømmen. Derfor opnås en repræsentativ stikprøvepopulation. Sonden kan monteres direkte på bioreaktoren, så den når ind i cellesuspensionen, eller den kan bruges i en steriliserbar by-pass. Sensor skallen er sluttet til systemet før sterilisering, de optiske dele er bagefter monteret i skallen.
Indtil nu, relevante industrielle mikroorganismer, f. eks, filamentøse svampe (diameter på op til over 200 μm), heterotrofisk mikroalger Crypthecodinium cohnii (gennemsnitlig celle diameter på 20 μm), og gær Saccharomyces cerevisiae (gennemsnitlig celle diameter på 5 μm), blev undersøgt med denne eller lignende anordninger, som er kort beskrevet.
Filamentøse svampe har tendens til at danne pellets under visse dyrkningsbetingelser. Disse er af en størrelse på op til flere hundrede μm. Hyfer af svampecellerne udvikler forskellige længder i afhængighed af den hydrodynamiske stress i væskefasen. Dette har en indflydelse på den metaboliske og vækst aktivitet, substrat optagelse og produktfrigivelse. ISM blev anvendt til at identificere pellet størrelsesfordelingen og bredden af zoner med lavere biomasse tæthed ved kanterne af pellets (egne ikke-offentliggjorte data).
Størrelsen af C. cohnii ændrer sig mellem 15 og 26 μm, når cellerne akkumulerer den flerumættede fedtsyre docosahexaensyre Acid (DHA) under kvælstof begrænsning. Denne bioteknologiske DHA-produktionsproces består af to dele, vækstfasen, hvor cellerne deler sig og bliver mindre, og produktionsfasen, hvor cellerne akkumulerer produktet og dermed bliver større. Derfor blev cellestørrelsen brugt til at bestemme proces tilstanden, hvor enten vækst-eller DHA-produktionen var gunstig. Endelig blev der fundet en sammenhæng mellem cellestørrelsen og DHA-indholdet. I dette tilfælde, ISM gør det muligt at overvåge intracellulære DHA akkumulering i realtid uden krav om prøvetagning, celle afbrydelse, og den fælles gaskromatografi analyse10.
Spirende gær er normalt af en størrelse mellem 3 og 8 μm. Andelen af celler, der er i modning tilstand ad gangen, som beskrevet med spirende indeks (BI), giver oplysninger om vækst vitalitet11,12, og selv en relation med rekombinant protein sekretion er blevet bevist13. Ved hjælp af ISM blev spirende og ikke-spirende gærceller (celler med og uden opløbet) fremtrædende14. Stress betingelser kan også føre til en bredere variation af cellestørrelsen inden for en gær population, som for nylig vist i Scale-down dyrkning, hvor betingelserne for storstilet næringsstof-begrænset fodret-batch dyrkning blev efterlignes3.
Derfor har ISM potentiale til at overvåge vækst vitalitet og produkt dannelse på et enkelt celleniveau i alle stadier af en bioprocess til identifikation af optimale dyrkningsforhold eller med henblik på proceskontrol. De metoder, der er beskrevet her, fokuserer på mikrobielle anvendelser med enkeltceller, men gælder også for større partikler som humane og animalske celler, celle agglomerater og pellets af filamentøse organismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

In situ monitorering i mikrobielle bioprocesser er for det meste begrænset til kemiske og fysiske egenskaber af mediet (f. eks.pH-værdi og koncentrationen af opløst ilt). Ikke desto mindre kan morfologien af celler være en passende indikator for optimale betingelser, da det ændrer sig med afhængighed af vækst tilstand, produkt ophobning og celle stress. Desuden giver en enkelt celle størrelsesfordeling ikke kun oplysninger om dyrkningsforholdene, men også om befolkningens heterogenitet. For at få sådanne oplysninger, en foto-optisk in situ mikroskopi enhed1 blev udviklet for at muliggøre overvågning af enkelt Cellestørrelse fordeling direkte i cellen suspension i bioreaktorer. En automatiseret billedanalyse er koblet til mikroskopi baseret på en neuralt netværksmodel, som er uddannet med bruger kommenterede billeder. Flere parametre, som er opnået fra erobringen af mikroskop, er korreleret til at behandle relevante funktioner i cellerne, ligesom deres metaboliske aktivitet. Indtil nu blev den præsenterede in situ mikroskopi sonde serie anvendt til at måle pellet størrelsen i filamentøse svampe suspensioner. Det blev brugt til at skelne enkelt Cellestørrelse i mikroalger dyrkning og relatere det til lipid ophobning. Formen af cellulære partikler var relateret til spirende i gær kulturer. Mikroskopi analysen kan generelt opdeles i tre trin: (i) image erhvervelse, (II) partikel identifikation, og (III) dataanalyse, hhv. Alle trin skal tilpasses til organismen, og derfor kræves der specifikke kommenterede oplysninger for at opnå pålidelige resultater. Evnen til at overvåge ændringer i cellernes morfologi direkte i line eller on line (i en by-pass) muliggør realtids værdier for overvågning og kontrol, i procesudvikling samt i produktionsskala. Hvis off line data korrelerer med real-time data, de nuværende kedelige off line målinger med ukendte påvirkninger på Cellestørrelse bliver unødvendigt.

Cellestørrelsen detektion i gær kulturer med ISM og automatiseret billed detektering til at skelne mellem spirende og ikke-vordende celler blev gennemført med succes. Både stroboskop intensiteten og valget af måle gabet har en række tolerance, hvor partikel identifikationen ikke påvirkes. F. eks. blev S. cerevisiae -celler målt med forskellige stroboskop intensiteter inden for et Variations interval på 11% ved en tør biomasse koncentration på 4 g L-1. De til...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

En foto-optisk in situ mikroskopi enhed blev udviklet til at overvåge størrelsen af enkeltceller direkte i cellen suspension. Real-time målingen udføres ved at koble den fotooptiske steriliserbare sonde til en automatiseret billedanalyse. Morfologiske ændringer vises med afhængighed af vækst tilstand og dyrkningsbetingelser.

In situ Mikroskopi for realtids bestemmelse af enkelt celle morfologi i Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om befolkningens heterogenitet gennem den morfologiske vurdering af cellerne. In situ mikroskopi tillader undersøgelse dyrkning betingelser, proces udbytter, og produktkvalitet. Den største fordel ved denne teknik er en in situ-måling, som giver realtidsdata uden prøveudtagning eller risiko for kontaminering.In situ mikroskopi koblet til automatiseret billedgenkendelse kan give yderligere oplysninger om cellulære strukturer, form og celle agglomeration ud over størrelse. Det er også muligt at måle cellekoncentrationer. Metoden har vist sig at være et pålideligt værktøj.Ingen alternativ metode giver de samme oplysninger på så kort tid og en lav indsats for prøveforberedelse. Metoden er blevet tilpasset forskellige bioprocesser og mikroorganismer, SEG-filamentøse svampe, mikroallergi og gær. Sonden bruges sammen med en computer.Hardwaren består af en enkelt stangsonde med et CCD-kamera i høj opløsning. Celler, der passerer gennem et justerbart målehul, afbildes af kameraet. Lys kommer ind i hullet overfor kameraet, hvilket betyder belysning er ved transmission.Angiv de hardwareparametre, der skal bruges til cellekoncentrationer, der strækker sig over det forventede område. Begynd at forberede sig til offlinemålinger. Brug en tykkelsesmåler til at justere målegabet.Drej derefter sondeskruen møtrik for at indstille målehullet til fem eller 10 gange den maksimale forventede cellediameter. Åbn sondecontrollersoftwaren ved computeren. I softwaren skal du vælge den ønskede sonde og gå til sektionshandlinger.Tryk derefter på Opret forbindelse. Gå derefter til fanen Sondekontrol, og åbn den. Start videostreaming ved at trykke på afspilningsknappen.Fastgør sonden til et stativ, og udfør følgende trin for hver måling. Arbejd med sonden og spray ethanol i målehullet. Tør forsigtigt støv eller snavs af med optisk papir.Ved computeren skal du bruge live view til at kontrollere, at sensorens glas er fri for partikler. Dernæst skal du placere et tørt optisk papir i målehullet for at fokusere. Drej bindeskruen for at flytte fokus manuelt.Stop med at fokusere, når enkelte fibre af papiret i målehullet tydeligt ses. Nu får et rør fyldt med kultur bouillon. Dyp mikroskopet i bouillon, så hullet er fuldt dækket med celle suspension.Brug bindingsskruerne til at finjustere fokus på cellerne. Når dette fokus er gjort, skal du ikke ændre det igen under eksperimentet. Vend tilbage til softwaren til eksperimentet.Gå til menuen Udløser. Angiv billedhastigheden under menuen Udløser. En hertz anbefales til offline målinger.Derfra skal du gå til feltet Frames Per Trigger og indstille det som nødvendigt for god statistik. Her, omkring 200. Gå også til menuen Generelt.Der skal du vælge den mappe, hvor billederne skal gemmes. Start anskaffelse af billede med knappen Start anskaffelse af billedudløser. Bevæg forsigtigt røret for at fremkalde flow i målehullet.Brug billederne fra eksperimentets første kørsel som et træningssæt. Har open source-softwaren Fiji klar og slip billederne fra eksperimentet ind i dets vindue. Når du er færdig, skal du vælge Analysér efterfulgt af Værktøjer og derefter på ROI Manager.Vælg derefter et markeringsværktøj. På billedet skal du beslutte dig for en partikel, der skal anmærkes, og som er i fokus. Tegn en cirkel rundt om den med markeringsværktøjet.Tryk på Tilføj for at føje anmærkningen til ROI Manager. Vælg derefter et penselværktøj, og vælg en passende pixelstørrelse. Brug penselværktøjet til at indsnævre markeringen.Fortsæt med at markere alle objekter af interesse på samme måde på omkring 15 billeder. Gem de kommenterede filer, og brug dem som et træningssæt. Når genkendelsesalgoritmen er trænet og klar, kan du bruge den til at visualisere resultater.Gå til Filer efterfulgt af Importfil i Resultatanalyse. Vælg den ønskede resultatfil her. Fortsæt med at trykke på knappen Opret diagram.Vælg Distributionsdiagram. Dette vil vise den morfologiske fordeling af kulturen. Gå tilbage til Opret diagram for at vælge Følsomhedsplot.De viste oplysninger kan hjælpe med at bestemme, hvor mange celler der skal analyseres for at opnå den ønskede nøjagtighed. Udfør onlinemålinger, når du har udført offlinemålinger. For online målinger, forbinde sonden direkte til en bioreaktor.Når den er tilsluttet, steriliseres samlingen korrekt. Vælg Overvågning i dashboardet. Der er en afspilningsknap til at starte billedopkøb og en stopknap for at afslutte den.Tryk på afspilningsknappen. Ved bioreaktoren begynder inokulering af kulturen. Kameraet vil fange video af cellerne og automatisk identificere dem til analyse.Overvågningen giver online data om cellestørrelser og former af forskellige cellemorfologier under hele gæringen. Realtidsresultaterne kan formateres på forskellige måder og også eksporteres til yderligere analyse. Dette plot af kumulative fordelinger af S.Cerevisiae cellediameter er skabt af data analyseret ved hjælp af denne teknik.Det viser den automatiske cellegenkendelse er i stand til at skelne spirende og ikke-spirende celler. Den faste kurve er fordelingen i løbet af en dyrkning på tre timer. Den stiplede kurve er fordelingen af den samme dyrkning på syv timer.Den stiplede kurve repræsenterer data, der er indsamlet efter 13 timer. Anmærkningsproceduren er tidskrævende, men den er nøglen til at opnå den ønskede nøjagtighed for celleidentifikationen. Med denne procedure kan målingstiderne bruges til processtyring, hvis måletiderne er kortere end procesdynamikken.Denne teknik baner vejen for at bruge målingen af befolkningens heterogenitet som procesparameter for mikrobielle dyrkninger fra de tidlige procesudviklingstrin til produktionsskala.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantificering af Global diastolisk funktion ved Kinematisk Modeling-baseret analyse af Transmitral Flow via parametriserede diastolisk Filling Formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Håndholdt Tre-dimensionel Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Menneskelig angiografi og Funktionelle Prækliniske studier i Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Brug af Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging at måle realtid Ændringer i cellulær adhæsion og De-vedhæftning induceret af Matrix Ændring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic force mikroskopi Based Biopanning til isolering af Morfologi Specifikke reagenser mod TDP-43 varianter i amyotrofisk lateral sklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Måling TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Ved hjælp af et FRET-baseret assay Microscopy

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokol til Real-time 3D enkelt partikel Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...