Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

De auteurs zijn dankbaar voor de steun van het Duitse federale ministerie van economie en energie binnen het kader van ZIM-koop, project "Smart process inspectie", Grant No. ZF 4184201CR5.

Opmerking: de volgende stappen zijn nodig om de parameters aan te passen aan het respectieve micro-organisme en de cultuuromstandigheden. De afstelling van de sonde-instellingen duurt ongeveer 20 minuten voor een ervaren gebruiker. Een gedetailleerde beschrijving van de gereedschappen en stappen wordt gegeven in de bijbehorende sonde handleiding van SOPAT GmbH. In het algemeen zijn de hulpprogramma's die worden weergegeven in het volgende protocol nodig: (i) sonde-controller voor sonde-aanpassingen en beeld verw...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM zoals hier gepresenteerd met dezelfde of zeer soortgelijke apparaten werd gebruikt voor het meten van de morfologische dynamiek van schimmels, microalgen, en gistcellen, die de bepaling van de groei activiteit mogelijk, en in het geval van algen, intracellulaire product accumulatie. De sensor heeft geen beweegbare onderdelen en is rechtstreeks toepasbaar in elke standaard geroerd tank bioreactor, hetzij via een standaard poort of in een steriliseerbare by-pass. Omdat gist veel kleiner is dan algen, vereiste de afname...

Morfologische kenmerken van cellen zijn vaak gerelateerd aan de fysiologische toestand, een verbinding tussen vorm en functie bestaat voor veel toepassingen. De morfologie van een enkele cel wordt beïnvloed door de toestand van de groei, de leeftijd van de cel, osmotische en andere potentiële celspanningen of product accumulatie. Morfologische veranderingen van cellen zijn vaak een maatstaf voor de groei vitaliteit van een cultuur. Intracellulaire product synthese, lipide accumulatie in algen en inclusie lichaam vorming in bacteriën, onder andere, zijn gerelateerd aan de celgrootte ook. Celagglomeratie kan een andere factor zijn die het waard is om te onderzoeken, zoals onlangs samengevat2.
Populatie heterogeneities kunnen worden gekwantificeerd op basis van morfologische kenmerken van individuele cellen. Studies toonden aan dat heterogeniteit binnen een cultuur significant zou kunnen zijn, bijvoorbeeldbij grootschalige productieomstandigheden3 de totale opbrengst kan worden beïnvloed door een lage prestatie van subpopulaties4.
Gewoonlijk wordt de beoordeling van morfologische kenmerken van cellen uitgevoerd door manuele bemonstering of met een door-Pass-stroom kamer gekoppeld aan een foto-optisch apparaat. Dit leidt tot verschillende beperkingen: de beperkte hoeveelheid verworven gegevens kan nauwelijks statistisch betrouwbare metingen leveren; de tijdsvertraging tussen de bemonstering en de toegankelijkheid van de resultaten kan te lang zijn in vergelijking met de dynamiek van het proces; en belangrijkste, de bemonsteringsprocedure (locatie van de bemonsteringspoort, voor behandeling van het monster vóór de meting, ongunstige omstandigheden in de bemonstering of bypass buis) kan een partijdige fout veroorzaken, omdat de voorbeeldprocedure zelf al van invloed kan zijn op de cel Morfologie. Ten slotte bestaat er altijd een hoog risico op verontreiniging tijdens de bemonstering of in by-pass-oplossingen, als deze niet steriliseerbaar zijn.
De toepassing van in-situ microscopie (ISM) kan verschillende van deze problemen omzeilen. Als cellen automatisch worden gedetecteerd, kan een juiste identificatie van hun morfologische kenmerken worden onderzocht5. Tot nu toe waren de belangrijkste beperkingen van deze methode (i) de evaluatietijd van beelden, die te lang was voor in-situ toepassingen, en (II) de slechte resolutie van beelden, vooral bij hoge celdichtheid. Hoewel eerste oplossingen van ISM omvatte mechanische bemonstering, verdunning van de sonde, of waren beperkt tot een by-pass systeem6,7, verdere benaderingen maken het vastleggen van de cel schorsing rechtstreeks8.
Recente vooruitgang in ISM zorgt voor de in-lijn of on- Line bewaking van cellen op één celbasis, die de verspreiding van morfologische parameters in real-time rechtstreeks in celsuspensies bij aanzienlijk hoge celconcentraties verschaft. Door middel van off line analyses van de belangrijkste parameters van de cellen, kunnen correlaties worden geïdentificeerd met informatie die wordt verstrekt door de gekoppelde geautomatiseerde celdetectie en ism. Vervolgens worden nieuwe soft-sensor ontwerpen bereikt, waarbij een onmeetbaar parameter wordt geschat met de eencellige morfologie.
In dit rapport wordt het ISM uitgevoerd door een fotooptische sonde te koppelen aan een geautomatiseerde beeldanalyse. Het ISM bestaat uit een sensor sonde met één staaf die het mogelijk maakt om beelden binnen een bekende Focus range in een instelbare meet kloof te vangen met een CCD-camera met hoge resolutie [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) en MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. De flitslicht verlichting wordt uitgevoerd door transmissie. Daarom is het licht afkomstig van de tegenoverliggende kant van de camera9 en kan de intensiteit ervan worden aangepast. Cellen passeren continu door deze kloof met de vloeistofstroom. Daarom wordt een representatieve steekproefpopulatie verkregen. De sonde kan direct aan de bioreactor worden gemonteerd, zodat deze in de celsuspensie terechtkomt, of kan worden gebruikt in een doorgang gesterseerbaar. De sensor shell is aangesloten op het systeem voorafgaand aan sterilisatie, de optische onderdelen worden daarna in de shell gemonteerd.
Tot nu, relevante industriële micro-organismen, bijvoorbeeld, filamenteeuze schimmels (diameter tot meer dan 200 μm), de heterotrofe microalg Crypthecodinium cohnii (gemiddelde celdiameter van 20 μm), en de gist Saccharomyces cerevisiae (gemiddelde celdiameter van 5 μm), werden onderzocht met deze of soortgelijke apparaten, die binnenkort wordt beschreven.
Filamenteuze schimmels hebben de neiging om pellets te vormen onder bepaalde teeltomstandigheden. Deze zijn van een grootte van maximaal enkele honderden μm. De schimmeldraden van de schimmelcellen ontwikkelen verschillende lengtes in afhankelijkheid van de hydrodynamische spanning in de vloeistoffase. Dit heeft een invloed op de metabole en groei activiteit, substraat opname en product release. ISM werd toegepast om de korrelgrootte verdeling en de breedte van zones van lagere dichtheid van de biomassa aan de randen van de pellets (eigen niet-gepubliceerde gegevens) te identificeren.
De grootte van C. cohnii verandert tussen 15 en 26 μm wanneer cellen accumuleren het meervoudig onverzadigde vetzuur Docosahexaeenzuur (DHA) onder stikstof beperking. Dit biotechnologische DHA-productieproces bestaat uit twee delen, de groeifase, waarin cellen zich delen en kleiner worden, en de productiefase, waarin cellen het product accumuleren en dus groter worden. Daarom werd de celgrootte gebruikt om de processtatus te bepalen, waarbij ofwel groei of DHA-productie gunstig was. Ten slotte is een correlatie tussen de celgrootte en de DHA-inhoud gevonden. In dit geval maakt ISM het mogelijk om de accumulatie van intracellulaire DHA in real time te bewaken zonder de vereiste van bemonstering, celverstoring en de gemeenschappelijke gaschromatografie-analyse10.
Ontluikende gist is meestal van een grootte tussen 3 en 8 μm. Het aandeel van cellen in de rijpings toestand op een tijdstip, zoals beschreven met de ontluikende index (BI), verschaft informatie over de groei vitaliteit11,12, en zelfs een relatie met recombinant eiwit secretie is bewezen13. Met behulp van ISM werden ontluikende en niet-ontluikende gistcellen (cellen met en zonder knop)14onderscheiden. Stress omstandigheden kunnen ook leiden tot een bredere variatie van de celgrootte binnen een gist populatie, zoals onlangs weergegeven in Scale-down cultivaties, waarin de voorwaarden van grootschalige nutriënt-beperkte fed-batch cultivaties werden geïmiteerd3.
Daarom heeft ISM het potentieel om de groei vitaliteit en product vorming op één celniveau te monitoren tijdens alle stadia van een Bioprocess voor de identificatie van optimale kweek condities, of voor het doel van procesbeheersing. De hier beschreven methoden zijn gericht op microbiële toepassingen met enkelvoudige cellen, maar zijn ook toepasbaar op grotere deeltjes zoals menselijke en dierlijke cellen, celagglomeraten en pellets van filamenteuze organismen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

In-situ monitoring in microbiële bioprocessen is meestal beperkt tot chemische en fysische eigenschappen van het medium (bijv.pH-waarde en de concentratie opgeloste zuurstof). Niettemin, de morfologie van cellen kan een geschikte indicator voor optimale omstandigheden, omdat het verandert met afhankelijkheid van de groei toestand, product accumulatie en cel stress. Bovendien biedt de eencellige distributie niet alleen informatie over de teelt condities, maar ook over de heterogeniteit van de populatie. Om dergelijke informatie te verkrijgen, werd een foto-optisch in situ microscopie apparaat1 ontwikkeld om de bewaking van de eencellige grootte distributie rechtstreeks in de celsuspensie in bioreactoren mogelijk te maken. Een geautomatiseerde beeldanalyse is gekoppeld aan de microscopie op basis van een Neural Network-model, dat is getraind met afbeeldingen met een gebruiker aantekeningen. Verschillende parameters, die worden opgedaan met de opnamen van de Microscoop, zijn gecorreleerd aan het proces van relevante kenmerken van de cellen, zoals hun metabole activiteit. Tot nu toe werd de gepresenteerde in situ microscopie sonde serie toegepast om de korrelgrootte te meten bij de suspensies van filamenteuze schimmels. Het werd gebruikt om de eencellige grootte in de microalgen teelt te onderscheiden en te relateren aan lipide accumulatie. De vorm van cellulaire deeltjes was gerelateerd aan ontluikende in gist culturen. De microscopie analyse kan over het algemeen in drie stappen worden opgesplitst: (i) beeld verwerving, (II) deeltjes identificatie, en (III) gegevensanalyse, respectievelijk. Alle stappen moeten worden aangepast aan het organisme, en daarom is specifieke geannoleerde informatie vereist om betrouwbare resultaten te bereiken. De mogelijkheid om veranderingen in celmorfologie direct in lijn of op lijn te monitoren (in een by-pass) maakt real-time waarden mogelijk voor bewaking en controle, zowel in procesontwikkeling als op productieschaal. Als de off line gegevens correleert met de real-time gegevens, worden de huidige vervelende off line metingen met onbekende invloeden op de celgrootte onnodig.

De celgrootte detectie in gist culturen met de ISM en geautomatiseerde beeld detectie om onderscheid te maken tussen ontluikende en niet-ontluikende cellen werd met succes uitgevoerd. Zowel de intensiteit van de stroboscoop als de keuze van de meet kloof hebben een tolerantiebereik, waarbij de deeltjes identificatie niet wordt aangetast. Bijvoorbeeld, S. cerevisiae cellen werden gemeten met verschillende stroboscoop intensiteiten binnen een variatie bereik van 11% bij een droge b...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Een foto-optisch in situ microscopie apparaat is ontwikkeld om de grootte van afzonderlijke cellen direct in de celsuspensie te bewaken. De real-time meting wordt uitgevoerd door de foto-optische steriliseerbare sonde te koppelen aan een geautomatiseerde beeldanalyse. Morfologische veranderingen verschijnen met afhankelijkheid van de groei toestand en de teeltomstandigheden.

In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen van de bevolking heterogeniteit door de morfologische beoordeling van de cellen. In situ microscopie maakt studie teelt voorwaarden, proces opbrengsten, en productkwaliteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een in situ-meting, die real-time gegevens levert zonder bemonstering of het risico van besmetting met zich meebrengt.In situ microscopie gekoppeld aan geautomatiseerde beeldherkenning kan aanvullende informatie over cellulaire structuren, vorm en cel agglomeratie meer dan grootte. Het is ook mogelijk om celconcentraties te meten. De methode heeft bewezen een betrouwbaar hulpmiddel te zijn.Geen enkele alternatieve methode biedt dezelfde informatie in zo'n korte tijd en lage inspanning voor de voorbereiding van monsters. De methode is aangepast aan verschillende bioprocessen en micro-organismen, SEG filamenteuze schimmels, micro-allergie, en gist. De sonde wordt gebruikt in combinatie met een computer.De hardware bestaat uit een enkele staafsonde met een CCD-camera met hoge resolutie. Cellen die door een verstelbare meetspleet gaan, worden door de camera in beeld gebracht. Licht komt in de opening tegenover de camera, wat betekent dat verlichting is door transmissie.Stel de hardwareparameters in met celconcentraties die het verwachte bereik bestrijken. Begin met het voorbereiden van offline metingen. Gebruik een diktemeter om de meetspleet aan te passen.Draai vervolgens de sondeschroefmoer om de meetkloof in te stellen op vijf of 10 keer de maximale verwachte celdiameter. Open op de computer de software van de sondecontroller. Selecteer in de software de gewenste sonde en ga naar sectieacties.Druk vervolgens op Connect. Ga vervolgens naar het tabblad Probe Control en open het. Start het streamen van video's door op de afspeelknop te drukken.Bevestig de sonde op een statief en voer de volgende stappen uit voor elke meting. Werk met de sonde en spuit ethanol in de meetkloof. Veeg vuil of vuil voorzichtig weg met optisch papier.Gebruik op de computer live weergave om te controleren of het glas van de sensor vrij is van deeltjes. Plaats vervolgens een droog optisch papier in de meetkloof voor scherpstellen. Draai de bindschroef om de scherpstelling handmatig te verplaatsen.Stop met scherpstellen wanneer enkele vezels van het papier in de meetkloof duidelijk zichtbaar zijn. Nu, neem een buis gevuld met cultuurbouillon. Dompel de microscoop in de bouillon, zodat de opening volledig is bedekt met celsuspensie.Gebruik de bindschroeven om de focus op de cellen te verfijnen. Zodra deze focus is gedaan, niet opnieuw veranderen tijdens het experiment. Ga terug naar de software voor het experiment.Ga naar het menu Triggering. Stel onder het menu Triggering de framesnelheid in. Eén hertz wordt aanbevolen voor offline metingen.Ga van daaruit naar het veld Frames Per trigger en stel deze in als nodig voor goede statistieken. Hier, ongeveer 200. Ga ook naar het algemene menu.Selecteer daar de map waarin de afbeeldingen worden opgeslagen. Begin met het verwerven van afbeeldingen met de knop Aankoop van de trigger starten. Beweeg de buis voorzichtig om de stroom in de meetspleet te induceren.Gebruik de afbeeldingen uit de eerste run van het experiment als trainingsset. Hebben de open source software Fiji klaar en drop de beelden van het experiment in het venster. Wanneer u klaar bent, selecteert u Analyseren, gevolgd door Hulpmiddelen en vervolgens ROI Manager.Kies vervolgens een selectiegereedschap. In de afbeelding, beslissen over een deeltje te annoteren dat is in focus. Teken er een cirkel omheen met het selectiegereedschap.Druk op Toevoegen om de annotatie toe te voegen aan de ROI Manager. Selecteer vervolgens een penseelgereedschap en kies een geschikte pixelgrootte. Gebruik het penseel om de selectie te verfijnen.Doorgaan met het markeren van alle objecten van belang op dezelfde manier op ongeveer 15 beelden. Sla de geannoteerde bestanden op en gebruik ze als trainingsset. Wanneer het herkenningsalgoritme is getraind en gereed, gebruikt u het om resultaten te visualiseren.Ga in de resultatenanalyse naar Bestand, gevolgd door Bestand importeren. Selecteer daar het gewenste resultatenbestand. Ga verder door op de knop Grafiek maken te drukken.Selecteer Distributiediagram. Dit zal de morfologische verspreiding van de cultuur weergeven. Ga terug naar Grafiek maken om gevoeligheidsplot te selecteren.De weergegeven informatie kan helpen bepalen hoeveel cellen moeten worden geanalyseerd om de gewenste nauwkeurigheid te verkrijgen. Voer online metingen uit na het voltooien van offline metingen. Voor online metingen sluit u de sonde rechtstreeks aan op een bioreactor.Eenmaal aangesloten, goed steriliseren van de montage. Selecteer Bewaking in het dashboard. Er is een afspeelknop om de aankoop van afbeeldingen te starten en een stopknop om deze te beëindigen.Druk op de afspeelknop. Bij de bioreactor, beginnen inenting van de cultuur. De camera legt video van de cellen vast en identificeert ze automatisch voor analyse.De monitoring biedt online gegevens van celgroottes en vormen van verschillende celmorfologieën tijdens de gehele fermentatie. De real-time resultaten kunnen op verschillende manieren worden opgemaakt en ook worden geëxporteerd voor verdere analyse. Dit plot van cumulatieve distributies van S.Cerevisiae celdiameter wordt gemaakt op basis van gegevens geanalyseerd met behulp van deze techniek.Het toont de automatische celherkenning in staat is om ontluikende en niet-ontluikende cellen te onderscheiden. De vaste curve is de verdeling tijdens een teelt op drie uur. De gestippelde curve is de verdeling van dezelfde teelt op zeven uur.De onderbroken curve vertegenwoordigt gegevens verzameld op 13 uur. De annotatieprocedure is tijdrovend, maar het is de sleutel voor het bereiken van de gewenste nauwkeurigheid voor de celidentificatie. Met deze procedure, als de meettijden korter zijn dan de procesdynamiek, kan de real-time meting worden gebruikt voor procesbesturing.Deze techniek maakt de weg vrij voor het gebruik van de meting van de heterogeniteit van de bevolking als procesparameter voor microbiële teelten vanaf de vroege procesontwikkelingsstappen tot de productieschaal.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kwantificering van Global diastolische functie door Kinematisch Modeling-gebaseerde analyse van transmitraal Flow via de Geparameteriseerde diastolische Vullen formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Hand-held Driedimensionale opto-akoestische Imaging Probe voor Deep Tissue Human-angiografie en Functional preklinisch Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...