Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien du ministère fédéral allemand de l'économie et de l'énergie dans le cadre ZIM-Koop, projet "Inspection intelligente des processus", subvention non. ZF 4184201CR5.

REMARQUE : Les étapes suivantes sont nécessaires pour adapter les paramètres aux microorganismes et aux conditions de culture respectifs. L'ajustement des paramètres de la sonde dure environ 20 min pour un utilisateur expérimenté. Une description détaillée des outils et des étapes est donnée dans le manuel de sonde correspondant de SOPAT GmbH. En général, les outils qui sont présentés dans le protocole suivant sont nécessaires : (i) Contrôleur de sonde pour les ajustements de sonde et l'acquisiti...

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	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

L'ISM tel qu'il est présenté ici avec les mêmes dispositifs ou très similaires a été utilisé pour mesurer la dynamique morphologique des champignons, des microalgues et des cellules de levure, ce qui a permis de déterminer l'activité de croissance, et en cas d'algues, l'accumulation intracellulaire des produits. Le capteur n'a pas de pièces mobiles et est directement applicable dans n'importe quel bioréacteur de réservoir remué standard, soit par un port standard ou dans un contournement stérilisable. Puisq...

Les caractéristiques morphologiques des cellules sont souvent liées à l'état physiologique, un lien entre la forme et la fonction existe pour de nombreuses applications. La morphologie d'une seule cellule est influencée par l'état de croissance, l'âge de la cellule, les contraintes osmotiques et autres contraintes cellulaires potentielles ou l'accumulation de produits. Les changements morphologiques des cellules sont souvent une mesure de la vitalité de croissance d'une culture. La synthèse intracellulaire des produits, l'accumulation de lipides dans les algues et la formation du corps d'inclusion dans les bactéries, entre autres, sont également liées à la taille des cellules. L'agglomération cellulaire peut être un autre facteur qui vaut la peine d'être étudié tel que résumé récemment2.
Les hétérogénéités de population peuvent être quantifiées en fonction des caractéristiques morphologiques des cellules individuelles. Des études ont montré que l'hétérogénéité au sein d'une culture pouvait être significative, par exemple,dans des conditions de production à grande échelle3 le rendement global pourrait être affecté par une faible performance des sous-populations4.
Habituellement, l'évaluation des caractéristiques morphologiques des cellules est effectuée par échantillonnage manuel ou avec une chambre de contournement couplée à un dispositif photo-optique. Cela conduit à plusieurs restrictions : la quantité limitée de données acquises peut difficilement fournir des mesures statistiquement fiables ; le délai entre l'échantillonnage et l'accessibilité des résultats peut être trop long par rapport à la dynamique du processus; et le plus important, la procédure d'échantillonnage (emplacement du port d'échantillonnage, prétraitement de l'échantillon avant la mesure, conditions défavorables dans le tube d'échantillonnage ou de dérivation) peut déclencher une erreur biaisée car la procédure de l'échantillon elle-même peut déjà affecter les cellules Morphologie. Enfin, il existe toujours un risque élevé de contamination lors de l'échantillonnage ou dans les solutions de contournement, si elles ne sont pas stérilisables en place.
L'application de la microscopie in situ (ISM) peut contourner plusieurs de ces problèmes. Si les cellules sont détectées automatiquement, une identification correcte de leurs caractéristiques morphologiques peut être étudiée5. Jusqu'à présent, les principales limites de cette méthode étaient (i) le temps d'évaluation des images, qui était trop long pour les applications in situ, et (ii) la mauvaise résolution des images, en particulier à des densités cellulaires élevées. Bien que les premières solutions de l'ISM inclus l'échantillonnage mécanique, la dilution de la sonde, ou ont été limités à un système de contournement6,7, d'autres approches permettent la capture de la suspension cellulaire directement8.
Les progrès récents de l'ISM permettent la surveillance en ligne ou en ligne des cellules sur une base unicellulaire, ce qui permet la distribution de paramètres morphologiques en temps réel directement dans les suspensions cellulaires à des concentrations cellulaires considérablement élevées. Grâce à des analyses hors ligne des paramètres clés des cellules, des corrélations avec les informations fournies par la détection cellulaire automatisée couplée et l'ISM peuvent être identifiées. Ensuite, de nouvelles conceptions de capteurs souples sont réalisées, dans lesquelles un paramètre incommensurable est estimé avec la morphologie unicellulaire.
Dans ce rapport, l'ISM est réalisé en couplant une sonde photo-optique à une analyse d'image automatisée. L'ISM se compose d'une sonde de capteur à une tige qui permet la capture d'images dans une plage de mise au point connue dans un espace de mesure réglable avec une caméra CCD haute résolution [MM-Ho - CCD GT2750 (2750x2200) et MM 2.1 - CMOS G507c (2464x2056)]. L'éclairage de la lumière du flash est effectué par transmission. Par conséquent, la lumière provient du côté opposé de la caméra9 et son intensité peut être ajustée. Les cellules passent continuellement à travers cette lacune avec le flux liquide. Par conséquent, un échantillon représentatif de population est obtenu. La sonde peut être montée directement sur le bioréacteur de sorte qu'elle atteint dans la suspension cellulaire, ou il peut être utilisé dans un by-pass stérilisable. La coque du capteur est connectée au système avant la stérilisation, les pièces optiques sont ensuite montées dans la coquille.
Jusqu'à présent, les micro-organismes industriels pertinents, par exemple,les champignons filamenteux (diamètre de plus de 200 m), les microalgues hétérotrophes Crypthecodinium cohnii (diamètre cellulaire moyen de 20 m), et la levure Saccharomyces cerevisiae (diamètre cellulaire moyen de 5 m), ont été étudiés avec ce dispositif ou similaire, qui est peu décrit.
Les champignons filamenteux ont tendance à former des granulés dans certaines conditions de culture. Celles-ci sont d'une taille allant jusqu'à plusieurs centaines de m. Les hyphes des cellules fongiques développent différentes longueurs dans la dépendance au stress hydrodynamique dans la phase fluide. Cela a une influence sur l'activité métabolique et de croissance, l'apport de substrat et la libération du produit. L'ISM a été appliqué pour identifier la répartition de la taille des granulés et la largeur des zones de faible densité de biomasse aux bords des granulés (données inédites).
La taille de C. cohnii change entre 15 et 26 m lorsque les cellules accumulent l'acide docosahexaénoïque polyinsaturé (DHA) sous limitation d'azote. Ce processus de production biotechnologique de DHA se compose de deux parties, la phase de croissance, dans laquelle les cellules se divisent et deviennent plus petites, et la phase de production, dans laquelle les cellules accumulent le produit et deviennent ainsi plus grandes. Par conséquent, la taille de la cellule a été utilisée pour déterminer l'état du processus, dans lequel la croissance ou la production de DHA était favorable. Enfin, une corrélation entre la taille de la cellule et le contenu DHA a été trouvée. Dans ce cas, ISM permet de surveiller l'accumulation intracellulaire de DHA en temps réel sans l'exigence de l'échantillonnage, la perturbation cellulaire, et l'analyse commune de chromatographie de gaz10.
La levure en herbe est généralement d'une taille comprise entre 3 et 8 m. La proportion de cellules qui sont dans l'état de maturation à la fois, comme décrit avec l'indice en herbe (BI), fournit des informations sur la vitalité de la croissance11,12, et même une relation avec la sécrétion de protéines recombinantes a étéprouvé13. Avec l'aide de l'ISM, les cellules de levure en herbe et non-budding (cellules avec et sans bourgeon) ont été distingués14. Les conditions de stress peuvent également conduire à une plus grande variation de la taille des cellules au sein d'une population de levures, comme l'ont montré récemment les cultures à l'échelle, dans lesquelles les conditions de grandes cultures à teneur en eau à teneur limitée en nutriments ont été imitées3.
Par conséquent, l'ISM a le potentiel de surveiller la vitalité de la croissance et la formation de produits au niveau d'une seule cellule à toutes les étapes d'un bioprocessus pour l'identification de conditions de culture optimales, ou aux fins de contrôle des processus. Les méthodes décrites ici sont axées sur les applications microbiennes avec des cellules individuelles, mais sont également applicables aux particules plus grosses comme les cellules humaines et animales, les agglomérats cellulaires et les granulés d'organismes filamenteux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

La surveillance in situ des bioprocessus microbiens se limite principalement aux propriétés chimiques et physiques du milieu(p. ex.la valeur du pH et la concentration d'oxygène dissous). Néanmoins, la morphologie des cellules peut être un indicateur approprié pour des conditions optimales, car elle change avec la dépendance à l'état de croissance, l'accumulation de produit et le stress cellulaire. En outre, la distribution de la taille d'une seule cellule fournit non seulement des informations sur les conditions de culture, mais aussi sur l'hétérogénéité de la population. Pour obtenir de telles informations, un dispositif de microscopie in situ photo-optique1 a été développé pour permettre la surveillance de la distribution de taille d'une seule cellule directement dans la suspension cellulaire dans les bioréacteurs. Une analyse automatisée de l'image est couplée à la microscopie basée sur un modèle de réseau neuronal, qui est formé avec des images annotées par l'utilisateur. Plusieurs paramètres, qui sont tirés des captures du microscope, sont corrélés au processus des caractéristiques pertinentes des cellules, comme leur activité métabolique. Jusqu'à présent, la série de sondes de microscopie in situ présentée s'appliquait pour mesurer la taille des granulés dans les suspensions de champignons filamenteuses. Il a été utilisé pour distinguer la taille d'une cellule unique dans la culture des microalgues et de le relier à l'accumulation de lipides. La forme des particules cellulaires était liée au bourgeonnement dans les cultures de levure. L'analyse de la microscopie peut généralement être divisée en trois étapes : (i) l'acquisition d'images, (ii) l'identification des particules et (iii) l'analyse des données, respectivement. Toutes les étapes doivent être adaptées à l'organisme, et donc des informations annotées spécifiques sont nécessaires afin d'obtenir des résultats fiables. La capacité de surveiller les changements dans la morphologie cellulaire directement en ligne ou en ligne (dans un contournement) permet des valeurs en temps réel pour la surveillance et le contrôle, dans le développement des processus ainsi que dans l'échelle de production. Si les données hors ligne sont en corrélation avec les données en temps réel, les mesures hors ligne fastidieuses actuelles avec des influences inconnues sur la taille de la cellule deviennent inutiles.

La détection de la taille des cellules dans les cultures de levure avec l'ISM et la détection automatisée d'image pour distinguer entre les cellules en herbe et non-budding a été menée avec succès. L'intensité du stroboscope et le choix de l'écart de mesure ont une gamme de tolérance, dans laquelle l'identification des particules n'est pas affectée. Par exemple, les cellules de S. cerevisiae ont été mesurées avec diverses intensités de stroboscope dans une gamme de...

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In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Un dispositif de microscopie in situ photo-optique a été développé pour surveiller la taille des cellules simples directement dans la suspension cellulaire. La mesure en temps réel est effectuée en couplant la sonde stérilisable photo-optique à une analyse automatisée de l'image. Des changements morphologiques apparaissent avec la dépendance à l'état de croissance et aux conditions de culture.

À Situ Microscopie pour la détermination en temps réel de la morphologie monocellulaire dans les bioprocessus

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’hétérogénéité de la population par l’évaluation morphologique des cellules. La microscopie in situ permet d’étudier les conditions de culture, les rendements des procédés et la qualité du produit. Le principal avantage de cette technique est une mesure in situ, qui fournit des données en temps réel sans échantillonnage ni risque de contamination.La microscopie in situ couplée à la reconnaissance automatisée de l’image peut fournir des informations supplémentaires sur les structures cellulaires, la forme et l’agglomération cellulaire au-delà de la taille. Il est également possible de mesurer les concentrations cellulaires. La méthode s’est avérée être un outil fiable.Aucune autre méthode ne fournit la même information en si peu de temps et un faible effort pour la préparation de l’échantillon. La méthode a été adaptée à divers bioprocédés et micro-organismes, champignons filamenteux SEG, micro-allergies et levures. La sonde est utilisée conjointement avec un ordinateur.Le matériel se compose d’une sonde à tige unique avec une caméra CCD haute résolution. Les cellules qui passent à travers un espace de mesure réglable sont photographiées par la caméra. La lumière entre dans l’espace en face de la caméra, ce qui signifie que l’éclairage se fait par transmission.Définissez les paramètres matériels à l’aide de concentrations cellulaires qui couvrent la plage prévue. Commencez à préparer des mesures hors ligne. Utilisez une jauge d’épaisseur pour ajuster l’écart de mesure.Tournez ensuite l’écrou de vis de sonde pour régler l’écart de mesure à cinq ou dix fois le diamètre maximum prévu de cellules. À l’ordinateur, ouvrez le logiciel du contrôleur de sonde. Dans le logiciel, sélectionnez la sonde désirée et passez aux actions de section.Appuyez ensuite sur Connect. Ensuite, allez à l’onglet Contrôle de sonde et ouvrez-le. Démarrez la diffusion vidéo en appuyant sur le bouton lecture.Fixez la sonde sur un trépied et effectuez les étapes suivantes pour chaque mesure. Travaillez avec la sonde et pulvérisez de l’éthanol dans l’écart de mesure. Essuyez soigneusement toute poussière ou saleté avec du papier optique.À l’ordinateur, utilisez la vue en direct pour vérifier que le verre du capteur est exempt de particules. Ensuite, placez un papier optique sec dans l’espace de mesure pour se concentrer. Tournez la vis de liaison pour déplacer la mise au point manuellement.Arrêtez de vous concentrer lorsque des fibres simples du papier dans l’écart de mesure sont clairement visibles. Maintenant, prends un tube rempli de bouillon de culture. Tremper le microscope dans le bouillon, de sorte que l’espace est entièrement recouvert de suspension cellulaire.Utilisez les vis de liaison pour affiner l’accent mis sur les cellules. Une fois cette mise au point terminée, ne la modifiez plus pendant l’expérience. Retour au logiciel pour l’expérience.Allez au menu Déclenchant. Sous le menu Déclenchement, réglez la fréquence d’image. Un hertz est recommandé pour les mesures hors ligne.De là, allez sur le champ Frames Per Trigger et définissez-le comme nécessaire pour de bonnes statistiques. Ici, environ 200. Aussi, allez au menu général.Là, sélectionnez l’annuaire dans lequel les images seront enregistrées. Commencez l’acquisition d’images avec le bouton Start Image Trigger Acquisition. Déplacez doucement le tube pour induire le flux dans l’écart de mesure.Utilisez les images de la première série de l’expérience comme un ensemble de formation. Préparez le logiciel open source Fidji et laissez tomber les images de l’expérience dans sa fenêtre. Une fois terminé, sélectionnez Analyser, suivi d’outils, puis roi manager.Ensuite, choisissez un outil de sélection. Dans l’image, décider d’une particule à annoter qui est au point. Dessinez un cercle autour d’elle avec l’outil de sélection.Appuyez sur Ajouter pour ajouter l’annotation au gestionnaire de retour sur investissement. Ensuite, sélectionnez un outil de pinceau et choisissez une taille de pixel appropriée. Utilisez l’outil brosse pour affiner la sélection.Continuez à marquer tous les objets d’intérêt de la même manière sur environ 15 images. Enregistrez les fichiers annotés et utilisez-les comme un ensemble de formation. Lorsque l’algorithme de reconnaissance est formé et prêt, utilisez-le pour visualiser les résultats.Dans l’analyseur de résultats, passez au fichier, suivi du fichier d’importation. Sélectionnez le fichier de résultats souhaité. Continuez en appuyant sur le bouton Créer un graphique.Sélectionnez Graphique de distribution. Cela montrera la distribution morphologique de la culture. Retournez à créer un graphique pour sélectionner l’intrigue de sensibilité.Les informations affichées peuvent aider à déterminer combien de cellules doivent être analysées pour obtenir l’exactitude désirée. Effectuez des mesures en ligne après avoir effectué des mesures hors ligne. Pour les mesures en ligne, connectez la sonde directement à un bioréacteur.Une fois connecté, stériliser correctement l’assemblage. Sélectionnez Surveillance dans le tableau de bord. Il y a un bouton de lecture pour démarrer l’acquisition d’image et un bouton d’arrêt pour y mettre fin.Appuyez sur le bouton de jeu. Chez le bioréacteur, commencer l’inoculation de la culture. La caméra capturera la vidéo des cellules et les identifiera automatiquement pour analyse.La surveillance fournit des données en ligne sur la taille des cellules et les formes des différentes morphologies cellulaires pendant toute la fermentation. Les résultats en temps réel peuvent être formatés de différentes manières et également exportés pour une analyse plus approfondie. Cette parcelle de distributions cumulatives du diamètre des cellules S.Cerevisiae est créée à partir de données analysées à l’aide de cette technique.Il démontre que la reconnaissance cellulaire automatique est capable de distinguer les cellules en herbe et non bourgeonnantes. La courbe solide est la distribution pendant une culture à trois heures. La courbe pointillée est la distribution de la même culture à sept heures.La courbe pointillée représente les données recueillies à 13 heures. La procédure d’annotation prend beaucoup de temps, mais elle est la clé pour atteindre l’exactitude souhaitée pour l’identification cellulaire. Avec cette procédure, si les temps de mesure sont plus courts que la dynamique du processus, la mesure en temps réel peut être utilisée pour le contrôle des processus.Cette technique ouvre la voie à l’utilisation de la mesure de l’hétérogénéité de la population comme paramètre de processus pour les cultures microbiennes, des premières étapes de développement des procédés à l’échelle de production.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Recherche

Bio-ingénierie

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Microscopie à balayage vidéo confocale et à taux Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantification de Global diastolique fonction de l&#39;analyse basée sur la modélisation cinématique de transmitral débit via le formalisme de remplissage diastolique paramétrée

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal à main en trois dimensions optoacoustique sonde d&#39;imagerie pour Deep Tissue angiographie humain et des études précliniques fonctionnels en temps réel

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Mesure de TCR-pMHC Reliure<em&gt; In Situ</em&gt; L&#39;aide d&#39;un essai basé sur la microscopie FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Une plate-forme de Microfluidic ultra haute capacité pour le séquençage du génome de cellules individuelles

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...