Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
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Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie im Rahmen von ZIM-Koop, Projekt "Smart Process Inspection", Zuschuss Nr. ZF 4184201CR5.

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind erforderlich, um die Parameter an die jeweiligen Mikroorganismen und Kulturbedingungen anzupassen. Die Einstellung der Sondeneinstellungen dauert für einen erfahrenen Benutzer ca. 20 min. Eine detaillierte Beschreibung der Werkzeuge und Schritte finden Sie im entsprechenden Prüfhandbuch der SOPAT GmbH. Im Allgemeinen werden die Werkzeuge benötigt, die im folgenden Protokoll dargestellt werden: (i) Probe Controller für Sondenanpassungen und Bildaufnahme; (ii) Fidschi (...

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	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. 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L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. 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M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM, wie hier mit den gleichen oder sehr ähnlichen Geräten vorgestellt, wurde verwendet, um die morphologische Dynamik von Pilzen, Mikroalgen und Hefezellen zu messen, die die Bestimmung der Wachstumsaktivität und im Falle von Algen, intrazelluläre Produktakkumulation ermöglicht. Der Sensor hat keine beweglichen Teile und ist direkt in jedem Standard-Rührbehälter-Bioreaktor einsetzbar, entweder über einen Standardport oder in einem sterilisierbaren Bypass. Da Hefe viel kleiner als Algen ist, erforderte die Reduzi...

Morphologische Merkmale von Zellen hängen oft mit dem physiologischen Zustand zusammen, eine Verbindung zwischen Form und Funktion besteht für viele Anwendungen. Die Morphologie einer einzelnen Zelle wird durch den Wachstumszustand, das Alter der Zelle, osmotische und andere potenzielle Zellspannungen oder Produktakkumulation beeinflusst. Morphologische Veränderungen von Zellen sind oft ein Maß für die Wachstumsvitalität einer Kultur. Intrazelluläre Produktsynthese, Lipidansammlung in Algen und Inklusionkörperbildung in Bakterien, unter anderem, sind auch mit der Zellgröße verbunden. Zellagglomeration kann ein weiterer Faktor sein, der es wert ist, untersucht zu werden, wie kürzlich zusammengefasst2.
Populationsheterogenitäten können anhand morphologischer Merkmale einzelner Zellen quantifiziert werden. Studien zeigten, dass Heterogenität innerhalb einer Kultur signifikant sein kann, z. B.könnte unter großflächigen Produktionsbedingungen3 der Gesamtertrag durch eine geringe Leistung der Subpopulationen beeinflusst werden4.
In der Regel erfolgt die Beurteilung morphologischer Merkmale von Zellen durch manuelle Probenahme oder mit einer Anpass-Durchflusskammer, die an ein fotooptisches Gerät gekoppelt ist. Dies führt zu mehreren Einschränkungen: Die begrenzte Menge der erfassten Daten kann kaum statistisch zuverlässige Messungen liefern; die Zeitverzögerung zwischen der Probenahme und der Zugänglichkeit der Ergebnisse kann im Vergleich zur Dynamik des Prozesses zu lang sein; und am wichtigsten ist, dass das Probenahmeverfahren (Standort des Probenahmeports, Vorbehandlung der Probeprobe vor der Messung, ungünstige Bedingungen in der Probenahme oder im Bypass-Rohr) einen verzerrten Fehler auslösen kann, da das Probenverfahren selbst bereits die Zelle beeinflussen kann. Morphologie. Schließlich besteht immer ein hohes Kontaminationsrisiko bei der Probenahme oder bei Umgehungslösungen, wenn sie nicht sterilisierbar sind.
Die Anwendung der In-situ-Mikroskopie (ISM) kann mehrere dieser Probleme umgehen. Wenn Zellen automatisch erkannt werden, kann eine korrekte Identifizierung ihrer morphologischen Merkmale vermessen werden5. Bisher waren die Haupteinschränkungen dieser Methode (i) die Auswertungszeit von Bildern, die für In-situ-Anwendungen zu lang war, und (ii) die schlechte Auflösung von Bildern, insbesondere bei hoher Zelldichte. Obwohl erste Lösungen von ISM mechanische Probenahme, Verdünnung der Sonde oder waren auf ein Umgehungssystem6,7beschränkt, weitere Ansätze ermöglichen die Erfassung der Zellsuspension direkt8.
Jüngste Fortschritte im ISM ermöglichen die inline- oder online-Überwachung von Zellen auf Einzelzellbasis, die die Verteilung morphologischer Parameter in Echtzeit direkt in Zellsuspensionen bei erheblich hohen Zellkonzentrationen ermöglicht. Durch Off-Line-Analysen der Schlüsselparameter der Zellen können Korrelationen mit Informationen identifiziert werden, die durch die gekoppelte automatisierte Zellerkennung und ISM bereitgestellt werden. Dann werden neue Softsensor-Designs erreicht, bei denen mit der einzelligen Morphologie ein nicht messbarer Parameter geschätzt wird.
In diesem Bericht wird das ISM durch Koppelung einer photooptischen Sonde an eine automatisierte Bildanalyse durchgeführt. Die ISM besteht aus einer einstabigen Sensorsonde, die die Aufnahme von Bildern innerhalb eines bekannten Fokusbereichs in einem einstellbaren Messspalt mit einer hochauflösenden CCD-Kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) und MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)] ermöglicht. Die Blitzlichtbeleuchtung erfolgt über die Übertragung. Daher stammt das Licht von der gegenüberliegenden Seite der Kamera9 und seine Intensität kann eingestellt werden. Zellen passieren diese Lücke kontinuierlich mit dem Flüssigkeitsfluss. Daher wird eine repräsentative Stichprobenpopulation ermittelt. Die Sonde kann direkt am Bioreaktor montiert werden, so dass sie in die Zellsuspension gelangt, oder sie kann in einem sterilisierbaren Bypass verwendet werden. Die Sensorhülle wird vor der Sterilisation mit dem System verbunden, die optischen Teile werden anschließend in die Schale montiert.
Bisher wurden relevante industrielle Mikroorganismen, z.B.fadenförmige Pilze (Durchmesser von bis zu über 200 m), die heterotrophen Mikroalgen Crypthecodinium cohnii (durchschnittlicher Zelldurchmesser von 20 m) und die Hefe Saccharomyces cerevisiae (durchschnittlicher Zelldurchmesser von 5 m) mit diesen oder ähnlichen Vorrichtungen untersucht, was kurz beschrieben wird.
Fadenförmige Pilze neigen dazu, Pellets unter bestimmten Anbaubedingungen zu bilden. Diese haben eine Größe von bis zu mehreren hundert m. Die Hyphen der Pilzzellen entwickeln unterschiedliche Längen in Abhängigkeit von der hydrodynamischen Belastung in der Fluidphase. Dies hat einen Einfluss auf die Stoffwechsel- und Wachstumsaktivität, substrataufnahme und Produktfreisetzung. ISM wurde angewendet, um die Pelletgrößenverteilung und die Breite von Zonen mit geringerer Biomassedichte an den Rändern der Pellets zu identifizieren (eigene unveröffentlichte Daten).
Die Größe von C. cohnii ändert sich zwischen 15 und 26 m, wenn Zellen die mehrfach ungesättigte Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) unter Stickstoffbegrenzung ansammeln. Dieser biotechnologische DHA-Produktionsprozess besteht aus zwei Teilen, der Wachstumsphase, in der sich Zellen teilen und kleiner werden, und der Produktionsphase, in der Zellen das Produkt ansammeln und dadurch größer werden. Daher wurde die Zellgröße verwendet, um den Prozesszustand zu bestimmen, in dem entweder Wachstum oder DHA-Produktion günstig war. Schließlich wurde eine Korrelation zwischen der Zellengröße und dem DHA-Inhalt gefunden. In diesem Fall ermöglicht ISM die Überwachung der intrazellulären DHA-Akkumulation in Echtzeit ohne die Notwendigkeit von Probenahme, Zellstörung und der gemeinsamen Gaschromatographie-Analyse10.
Budding Hefe ist in der Regel von einer Größe zwischen 3 und 8 m. Der Anteil der Zellen, die sich gleichzeitig im Reifezustand befinden, wie mit dem angehenden Index (BI) beschrieben, liefert Informationen über die Wachstumsvitalität11,12, und sogar eine Beziehung zur rekombinanten Proteinsekretion wurde13nachgewiesen. Mit Hilfe von ISM wurden angehende und nicht aufkeimende Hefezellen (Zellen mit und ohne Knospe)14unterschieden. Stressbedingungen können auch zu einer breiteren Variation der Zellgröße innerhalb einer Hefepopulation führen, wie kürzlich in scale-down-Kulturen gezeigt wurde, bei denen die Bedingungen für großflächige nährstoffbegrenzte Futter-Batch-Kulturen nachgeahmt wurden3.
Daher hat ISM das Potenzial, die Wachstumsvitalität und Produktbildung auf einzelzelliger Ebene in allen Phasen eines Bioprozesses zur Ermittlung optimaler Anbaubedingungen oder zum Zwecke der Prozesskontrolle zu überwachen. Die hier beschriebenen Methoden konzentrieren sich auf mikrobielle Anwendungen mit Einzelzellen, sind aber auch auf größere Partikel wie menschliche und tierische Zellen, Zellagglomerate und Pellets von fadenförmigen Organismen anwendbar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

Die In-situ-Überwachung in mikrobiellen Bioprozessen beschränkt sich meist auf chemische und physikalische Eigenschaften des Mediums(z.B.pH-Wert und Die Konzentration auf gelöster Sauerstoff). Dennoch kann die Morphologie der Zellen ein geeigneter Indikator für optimale Bedingungen sein, da sie sich mit Abhängigkeit vom Wachstumszustand, der Produktakkumulation und der Zellspannung ändert. Darüber hinaus liefert die Einzelzellgrößenverteilung nicht nur Informationen über die Anbaubedingungen, sondern auch über die Heterogenität der Population. Um solche Informationen zu erhalten, wurde ein fotooptisches In-situ-Mikroskopiongerät 1 entwickelt, um die Überwachung der einzelzelligen Größenverteilung direkt in der Zellsuspension in Bioreaktoren zu ermöglichen. Eine automatisierte Bildanalyse wird an die Mikroskopie gekoppelt, die auf einem neuronalen Netzwerkmodell basiert, das mit benutzerkommentierten Bildern trainiert wird. Mehrere Parameter, die aus den Aufnahmen des Mikroskops gewonnen werden, werden mit prozessrelevanten Merkmalen der Zellen korreliert, wie ihre metabolische Aktivität. Bisher wurde die vorgestellte In-situ-Mikroskopie-Sondenserie zur Messung der Pelletgröße in fadenförmigen Pilzsuspensionen eingesetzt. Es wurde verwendet, um die einzellige Größe in der Mikroalgenkultivatierzukultivierung zu unterscheiden und sie mit der Lipidakkumulation in Beziehung zu setzen. Die Form der zellulären Teilchen war mit dem Aufblühen in Hefekulturen verbunden. Die Mikroskopieanalyse kann im Allgemeinen in drei Schritte unterteilt werden: (i) Bildaufnahme, (ii) Partikelidentifikation bzw. (iii) Datenanalyse. Alle Schritte müssen an den Organismus angepasst werden, und daher sind spezifische, mit Anmerkungen bestellte Informationen erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die Möglichkeit, Veränderungen in der Zellmorphologie direkt in der Linie oder im Internet (in einer Umgehungskarte) zu überwachen, ermöglicht Echtzeitwerte für Überwachung und Steuerung, in der Prozessentwicklung sowie im Produktionsmaßstab. Wenn die Off-Line-Daten mit den Echtzeitdaten korrelieren, werden die aktuellen mühsamen Off-Line-Messungen mit unbekannten Einflüssen auf die Zellgröße überflüssig.

Die Zellgrößenerkennung in Hefekulturen mit dem ISM und die automatische Bilderkennung zur Unterscheidung zwischen angehenden und nicht aufkeimenden Zellen wurde erfolgreich durchgeführt. Sowohl die Stroboskopintensität als auch die Wahl des Messspalts weisen einen Toleranzbereich auf, bei dem die Partikelidentifikation nicht beeinträchtigt wird. So wurden z.B. S. cerevisiae Zellen mit verschiedenen Stroboskopintensitäten in einem Variationsbereich von 11% bei einer Trocken...

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In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Ein fotooptisches In-situ-Mikroskopiergerät wurde entwickelt, um die Größe einzelner Zellen direkt in der Zellsuspension zu überwachen. Die Echtzeitmessung erfolgt durch Kopplung der photooptischen sterilisierbaren Sonde an eine automatisierte Bildanalyse. Morphologische Veränderungen treten mit Abhängigkeit vom Wachstumszustand und den Anbaubedingungen auf.

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Populationsheterogenität durch die morphologische Bewertung der Zellen zu beantworten. Die In-situ-Mikroskopie ermöglicht Studienbedingungen, Prozesserträge und Produktqualität. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine In-situ-Messung, die Echtzeitdaten liefert, ohne Probenahme oder Kontaminationsgefahr.Die an die automatisierte Bilderkennung gekoppelte In-situ-Mikroskopie kann zusätzliche Informationen über Zellstrukturen, Form und Zellagglomeration über die Größe hinaus liefern. Es ist auch möglich, Zellkonzentrationen zu messen. Die Methode hat sich als zuverlässiges Werkzeug erwiesen.Keine alternative Methode liefert die gleichen Informationen in so kurzer Zeit und geringen Aufwand für die Probenvorbereitung. Die Methode wurde an verschiedene Bioprozesse und Mikroorganismen, SEG-Filamentpilze, Mikroallergien und Hefe angepasst. Die Sonde wird in Verbindung mit einem Computer verwendet.Die Hardware besteht aus einer einzigen Stabsonde mit einer hochauflösenden CCD-Kamera. Zellen, die einen einstellbaren Messspalt durchlaufen, werden von der Kamera ababgebildet. Licht dringt in die Lücke gegenüber der Kamera ein, was bedeutet, dass die Beleuchtung durch Übertragung erfolgt.Legen Sie die Hardwareparameter mithilfe von Zellenkonzentrationen fest, die den erwarteten Bereich umfassen. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für Offline-Messungen. Verwenden Sie ein Dickenmessgerät, um den Messspalt anzupassen.Drehen Sie dann die Sondenschneckenmutter, um den Messspalt auf das Fünf- oder Zehnfache des maximal erwarteten Zelldurchmessers einzustellen. Öffnen Sie am Computer die Prüfpunktsteuerungssoftware. Wählen Sie in der Software die gewünschte Sonde aus und gehen Sie zu Abschnittsaktionen.Drücken Sie dann Connect. Gehen Sie als Nächstes zur Registerkarte Probesteuerung und öffnen Sie sie. Starten Sie das Videostreaming, indem Sie die Wiedergabetaste drücken.Befestigen Sie die Sonde an einem Stativ, und führen Sie die folgenden Schritte für jede Messung aus. Arbeiten Sie mit der Sonde und sprühen Sie Ethanol in den Messspalt. Wischen Sie Staub oder Schmutz vorsichtig mit optischem Papier ab.Verwenden Sie am Computer die Live-Ansicht, um zu überprüfen, ob das Glas des Sensors frei von Partikeln ist. Legen Sie als Nächstes ein trockenes optisches Papier in den Messspalt, um es zu fokussieren. Drehen Sie die Bindungsschraube, um den Fokus manuell zu bewegen.Hören Sie auf zu fokussieren, wenn einzelne Fasern des Papiers im Messabstand deutlich zu sehen sind. Jetzt, bekommen Sie eine Röhre mit Kulturbrühe gefüllt. Tauchen Sie das Mikroskop in die Brühe, so dass der Spalt vollständig mit Zellsuspension bedeckt ist.Verwenden Sie die Bindungsschrauben, um den Fokus auf die Zellen zu optimieren. Sobald diese Fokussierung abgeschlossen ist, ändern Sie sie während des Experiments nicht mehr. Kehren Sie zur Software für das Experiment zurück.Wechseln Sie zum Menü Auslösen. Legen Sie im Menü Auslösen die Bildrate fest. Für Offline-Messungen wird ein Hertz empfohlen.Gehen Sie von dort aus zum Feld Frames pro Trigger und legen Sie es als notwendig für gute Statistiken fest. Hier etwa 200. Gehen Sie auch zum Menü Allgemein.Wählen Sie dort das Verzeichnis aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Beginnen Sie mit der Schaltfläche Bildtriggererfassung starten. Bewegen Sie das Rohr vorsichtig, um den Durchfluss im Messspalt zu induzieren.Verwenden Sie die Bilder aus dem ersten Versuch des Experiments als Trainingssatz. Haben Sie die Open-Source-Software Fidschi bereit und lassen Sie die Bilder aus dem Experiment in sein Fenster. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Analysieren, gefolgt von Tools und dann ROI Manager aus.Wählen Sie als Nächstes ein Auswahlwerkzeug aus. Entscheiden Sie im Bild für ein Zunotenelement, das im Fokus steht. Zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug einen Kreis um ihn herum.Drücken Sie Hinzufügen, um die Anmerkung zum ROI Manager hinzuzufügen. Wählen Sie als Nächstes ein Pinselwerkzeug aus, und wählen Sie eine entsprechende Pixelgröße aus. Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um die Auswahl zu verfeinern.Markieren Sie weiterhin alle Objekte von Interesse auf die gleiche Weise auf etwa 15 Bilder. Speichern Sie die annotierten Dateien, und verwenden Sie sie als Trainingssatz. Wenn der Erkennungsalgorithmus trainiert und bereit ist, verwenden Sie ihn, um Ergebnisse zu visualisieren.Wechseln Sie im Ergebnisanalyser zu Datei, gefolgt von Datei importieren. Wählen Sie dort die gewünschte Ergebnisdatei aus. Fahren Sie fort, indem Sie die Schaltfläche Diagramm erstellen drücken.Wählen Sie Verteilungsdiagramm aus. Dies zeigt die morphologische Verteilung der Kultur. Kehren Sie zum Diagramm erstellen zurück, um Sensitivitätsdiagramm auszuwählen.Anhand der angezeigten Informationen kann bestimmt werden, wie viele Zellen analysiert werden müssen, um die gewünschte Genauigkeit zu erhalten. Führen Sie Online-Messungen durch, nachdem Sie Offline-Messungen abgeschlossen haben. Für Online-Messungen können Sie die Sonde direkt an einen Bioreaktor anschließen.Nach dem Anschluss die Baugruppe richtig sterilisieren. Wählen Sie Überwachung im Dashboard aus. Es gibt eine Wiedergabe-Taste, um die Bildaufnahme zu starten, und eine Stopp-Taste, um sie zu beenden.Drücken Sie die Wiedergabetaste. Am Bioreaktor beginnen die Impfung der Kultur. Die Kamera erfasst Videos der Zellen und identifiziert sie automatisch zur Analyse.Die Überwachung liefert Online-Daten über Zellgrößen und -formen verschiedener Zellmorphologien während der gesamten Fermentation. Die Echtzeit-Ergebnisse können auf verschiedene Weise formatiert und auch zur weiteren Analyse exportiert werden. Dieses Diagramm der kumulativen Verteilungen des S.Cerevisiae Zelldurchmessers wird aus Daten erstellt, die mit dieser Technik analysiert werden.Es zeigt, dass die automatische Zellerkennung in der Lage ist, angehende und nicht aufkeimende Zellen zu unterscheiden. Die feste Kurve ist die Verteilung während eines Anbaus bei drei Stunden. Die gepunktete Kurve ist die Verteilung des gleichen Anbaus nach sieben Stunden.Die gestrichelte Kurve stellt Daten dar, die nach 13 Stunden gesammelt wurden. Die Anmerkungsprozedur ist zeitaufwändig, aber sie ist der Schlüssel, um die gewünschte Genauigkeit für die Zellenidentifikation zu erreichen. Bei diesem Verfahren kann die Echtzeitmessung für die Prozesssteuerung verwendet werden, wenn die Messzeiten kürzer sind als die Prozessdynamik.Diese Technik ebnet den Weg für die Messung der Populationsheterogenität als Prozessparameter für mikrobielle Kultivierungen von den frühen Prozessentwicklungsschritten bis zur Produktionsskala.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal-Hand Dreidimensionale Optoakustische Bildgebung Sonde für Deep Tissue Menschen Angiographie und Funktions präklinischen Studien in Echtzeit

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...