Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

המחברים אסירי תודה על תמיכתם של המשרד הפדרלי הגרמני לכלכלה ואנרגיה במסגרת צים-קופ, פרויקט "ביקורת תהליך חכם", להעניק לא. ZF 4184201CR5.

הערה: השלבים הבאים נחוצים כדי להתאים את הפרמטרים לתנאי המיקרואורגניזם והתרבות המתאימים. ההתאמה של הגדרות בדיקה נמשך כ 20 דקות עבור משתמש מנוסה. תיאור מפורט של כלים ושלבים ניתן במדריך המכשיר המתאים של SOPAT GmbH. באופן כללי, יש צורך בכלים המוצגים בפרוטוקול הבא: (i) בדיקת בקר עבור כוונוני בדיק?...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM כפי שהוצג כאן עם מכשירים זהים או דומים מאוד השתמשו כדי למדוד דינמיקה מורפולוגית של פטריות, מיקרואצות, ותאי שמרים, אשר איפשר את קביעת פעילות הצמיחה, ובמקרה של אצות, הצטברות מוצר תאיים. החיישן אינו כולל חלקים מטלטלין והוא ישים באופן ישיר בכל ביוריאקטור מעורבב סטנדרטי, או דרך נמל רגיל או steril...

תכונות מורפולוגיות של תאים קשורות בדרך כלל למצב הפיזיולוגי, חיבור בין הטופס לפונקציה קיים עבור יישומים רבים. המבנה של תא בודד מושפע ממצב הצמיחה, הגיל של התא, אוסמוטי ומדגיש תאים פוטנציאליים אחרים או הצטברות מוצר. שינויים מורפולוגיים של תאים הם לעתים קרובות מידה של חיוניות הצמיחה של התרבות. סינתזה המוצר התאיים, הצטברות ליפיד באצות היווצרות גוף הכללה בחיידקים, בין היתר, קשורים בגודל התא גם. הוצאת תא יכולה להיות גורם נוסף ששווה לחקור כפי שמסוכם לאחרונה2.
הטרוגניות של האוכלוסייה ניתן לכמת על בסיס תכונות מורפולוגיות של תאים בודדים. מחקרים הראו כי הטרוגניות בתוך תרבות עשויה להיות משמעותית, לדוגמה, תחת תנאי ייצור בקנה מידה גדול3 התשואה הכוללת עשויה להיות מושפעת ביצועים נמוכים של אוכלוסיות משנה4.
בדרך כלל, הערכה של תכונות מורפולוגיים של תאים מבוצעת על ידי דגימה ידנית או עם תא באמצעות מעבר זרם משולב למכשיר צילום אופטי. פעולה זו מובילה למספר הגבלות: הכמות המוגבלת של הנתונים הנרכשים בקושי יכולה לספק מדידות אמינות מבחינה סטטיסטית; עיכוב הזמן בין הדגימה לבין הנגישות של תוצאות עשוי להיות ארוך מדי בהשוואה לדינמיקה של התהליך; והחשוב ביותר, הליך הדגימה (מיקום יציאת הדגימה, טרום טיפול של המדגם לפני המדידה, תנאים שלילי בדגימה או לעקוף צינור) יכול לעורר שגיאה מוטה כמו ההליך לדוגמה עצמה יכול כבר להשפיע על התא ורפולוגיה. לבסוף, קיים תמיד סיכון גבוה לזיהום במהלך הדגימה או באמצעות העברת פתרונות, אם הם לא sterilizable במקום.
היישום של מיקרוסקופ באתרו (ISM) יכול לעקוף כמה מהבעיות הללו. אם התאים מזוהים באופן אוטומטי, ניתןלסקר אתהזיהוי הנכון של התכונות הורפולוגיות שלהם. עד היום, המגבלות העיקריות של שיטה זו היו (i) זמן ההערכה של תמונות, אשר היה ארוך מדי עבור יישומים באתרו , ו (ii) הרזולוציה הגרועה של תמונות, במיוחד בצפיפויות תאים גבוהים. למרות הפתרונות הראשונים של ISM כללו דגימה מכנית, דילול של המקדח, או היו מוגבלים על ידי-pass מערכת6,7, גישות נוספות לאפשר ללכוד את ההשעיה התא ישירות8.
ההתקדמות האחרונה ב-ISM מאפשרת את הקו או על ניטור קו של תאים על בסיס תא בודד, אשר מספק את ההתפלגות של פרמטרים מורפולוגיים בזמן אמת ישירות בתוך השעיות התא בריכוזים גבוהים במידה ניכרת של תאים. דרך ניתוח שורה של פרמטרי המפתח של התאים, היחסים עם מידע שסופקו על ידי זיהוי תא אוטומטי מצמידים ו ISM ניתן לזהות. לאחר מכן, מושגת עיצובים חדשים של חיישנים רכים, בהם פרמטר שאינו ניתן למדידה מוערך באמצעות מורפולוגיה של תא יחיד.
בדו ח זה, ISM מתנהל על ידי צימוד בדיקה צילום אופטי לניתוח תמונה אוטומטית. ISM מורכב בדיקה אחת מוט חיישן המאפשרת לכידת תמונות בתוך טווח המוקד הידוע בפער מדידה מתכווננת עם מצלמה CCD ברזולוציה גבוהה [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) ו MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)]. תאורת ההבזק מתבצעת באמצעות שידור. לכן, מקורו של האור מהצד הנגדי של המצלמה9 ועוצמתו ניתן לכוונן. תאים עוברים ברציפות דרך פער זה עם הזרימה הנוזלית. לפיכך, מתקבלת אוכלוסיית דוגמה ייצוגית. הגשוש יכול להיות רכוב ישירות על ביוריאקטור כך שהוא מגיע לתוך ההשעיה התא, או שהוא יכול לשמש sterilizable by-לעבור. מעטפת חיישן מחובר למערכת לפני עיקור, חלקים אופטיים מחוברים לאחר מכן לתוך המעטפת.
, עד עכשיו מיקרואורגניזמים תעשייתיים רלוונטיים, למשל, פטריות filamentous (קוטר של עד מעל 200 μm), את הheterotrophic מיקרואצות קריפטיום cohnii (קוטר תא ממוצע של 20 μm), ואת סכביפיסים שמרים cerevisiae ס (קוטר התא הממוצע של 5 μm), נחקרו עם זה או התקנים דומים, אשר תיאר בקרוב.
פטריות filamentous נוטים ליצור כדורי בתנאי טיפוח מסוימים. אלה הם בגודל של עד כמה מאות μm. הלקורבן התאים הפטרייתיים מפתחים באורכים שונים את התלות בלחץ ההידרודינמי בשלב הנוזלים. זה יש השפעה על פעילות מטבולית וצמיחה, ספיגת המצע ושחרור המוצר. ISM הוחל על זיהוי התפלגות גודל הגלולה ואת רוחב האזורים של צפיפות ביומסה נמוכה בקצות כדורי (נתונים שלא פורסמו).
בגודל של C. cohnii משנה בין 15 ו 26 יקרומטר כאשר התאים לצבור חומצה שומן רב בלתי רווי docosahexaenoic חומצה (DHA) תחת הגבלת חנקן. תהליך הייצור הביוטכנולוגי הזה מורכב משני חלקים, שלב הצמיחה, שבו התאים להפריד ולהיות קטנים יותר, ואת שלב הייצור, שבו תאים לצבור את המוצר וכך להיות גדול יותר. לכן, גודל התא שימש כדי לקבוע את מצב התהליך, שבו הצמיחה או הייצור DHA היה חיובי. לבסוף, המתאם בין גודל התא לבין תוכן ה-DHA נמצא. במקרה זה, ISM מאפשר לפקח על הצטברות DHA תאיים בזמן אמת ללא דרישה של דגימה, שיבוש התא, ואת כרומטוגרפיה משותף ניתוח גז10.
שמרים הנצה הוא בדרך כלל בגודל בין 3 ו 8 μm. היחס בין התאים הנמצאים במצב של בגרות בכל פעם, כפי שמתואר באינדקס החיים (BI), מספק מידע על חיוניות הצמיחה11,12, ואפילו קשר עם הפרשת חלבון רקומביננטי הוכח13. עם העזרה של ISM, הנצה ושלא הנצה תאים שמרים (תאים עם ובלי ניצן) היו מכובדים14. תנאי הסטרס יכולים גם להוביל לווריאציה רחבה יותר של גודל התא בתוך אוכלוסיית שמרים, כפי שניתן לראות לאחרונה בזנים הגדלים, בהם התנאים של זנים מוגבלים בקנה מידה מוגבל של מזינים-הזנת אצווהשלושה.
לפיכך, לISM יש פוטנציאל לפקח על חיוניות הצמיחה ועל היווצרות המוצר ברמה של תא בודד במהלך כל שלבי הביורורות לזיהוי מצבי טיפוח אופטימליים, או למטרת שליטה בתהליך. השיטות המתוארות כאן מתמקדות ביישומים מיקרוביאלית עם תאים בודדים, אך חלים גם על חלקיקים גדולים יותר כמו תאים אנושיים ובעלי חיים, תא אגלוגית וכדוריות של אורגניזמים filamentous.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

בניטור באתרו של חיידקים bioprocesses מוגבל בעיקר תכונות כימיות ופיזיות של המדיום (g., ערך ה-pH ואת ריכוז החמצן מומס). עם זאת, המבנה של התאים יכול להיות מחוון מתאים לתנאים אופטימליים, שכן הוא משתנה עם התלות במצב הגדילה, הצטברות המוצר ומתח התאים. יתרה מזאת, התפלגות הגודל בתא היחיד מספקת לא רק מידע על תנאי הטיפוח, אלא גם על הטרוגניות האוכלוסיה. כדי לקבל מידע כזה, צילום אופטי במכשיר מיקרוסקופ באתרו 1 פותחה כדי לאפשר את הניטור של התפלגות בגודל תא יחיד ישירות ההשעיה התא ב bioreactors. ניתוח תמונה אוטומטי משולב למיקרוסקופיה המבוססת על מודל רשת עצבי, אשר מאומן עם תמונות המשתמש מוערת. מספר פרמטרים, אשר השיגו מן לכידות של המיקרוסקופ, מתואמים את תהליך התכונות הרלוונטיות של התאים, כמו פעילות מטבולית שלהם. עד עכשיו, הציג את סדרת בדיקה מיקרוסקופית באתרו הוחל למדוד את גודל הגלולה בתוך שתלים פטריות filamentous. הוא שימש כדי להבדיל את הגודל תא יחיד בטיפוח מיקרואצות ולקשר אותו להצטברות השומנים. הצורה של חלקיקים סלולריים היה קשור הנצה בתרבויות שמרים. ניתוח מיקרוסקופ יכול להיות מפוצל בדרך כלל לתוך שלושה צעדים: (i) רכישת תמונה, (ii) זיהוי חלקיקים, ו (iii) ניתוח נתונים, בהתאמה. כל הצעדים צריך להיות מותאם לאורגניזם, ולכן מידע ספציפי מסומן נדרש על מנת להשיג תוצאות אמינות. היכולת לעקוב אחר שינויים במיורפולוגיה של התא ישירות בשורה או בשורה (באמצעות מעבר) מאפשרת ערכי זמן-אמת לניטור ולבקרה, בפיתוח תהליכים כמו גם בקנה מידה לייצור. אם נתוני הקו כבוי משפיעים על נתוני הזמן האמיתי, מדידות הקו המשוכבות הנוכחיות עם השפעות לא ידועות בגודל התא הופכות למיותר.

הזיהוי גודל התא בתרבויות שמרים עם ISM וזיהוי תמונה אוטומטית כדי להבדיל בין התאים הנצה ושאינם המ, נערך בהצלחה. הן בעוצמת הסטרובוסקופ והן בבחירת פער המדידה מגוון של עמידות, שבה זיהוי החלקיקים אינו מושפע. לדוגמה, תאים של ס. cerevisiae ס נמדדו עם עוצמות שונות של כוונות בתוך טווח...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

צילום אופטי במכשיר מיקרוסקופ באתרו פותחה כדי לפקח על גודל של תאים בודדים ישירות בתא ההשעיה. מדידה בזמן אמת מתבצעת על ידי צימוד sterilizable הבדיקה צילום אופטי לניתוח תמונה אוטומטית. שינויים מורפולוגיים מופיעים בתלות במצב הגדילה ובתנאי הטיפוח.

באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של הטרוגניות האוכלוסייה באמצעות הערכה מורפולוגית של התאים. במיקרוסקופיה של situ מאפשרת חקר תנאי טיפוח, תפוקות תהליכים ואיכות המוצר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מדידה במקום, המספק נתונים בזמן אמת ללא דגימה או להביא סיכון לזיהום.במיקרוסקופיה של situ, יחד עם זיהוי תמונה אוטומטי, ניתן לספק מידע נוסף אודות מבנים תאיים, צורה והתגנונות תאים מעבר לגודלם. אפשר גם למדוד ריכוזי תאים. השיטה הוכיחה להיות כלי אמין.שום שיטה חלופית אינה מספקת את אותו מידע בזמן כה קצר ובמאמץ נמוך להכנת מדגם. השיטה הותאמה לביו-מעבדים ומיקרואורגניזמים שונים, פטריות סיסיביות SEG, מיקרו אלרגיה ושמרים. הגשוש משמש בשילוב עם מחשב.החומרה מורכבת מבדיקה מוט יחיד עם מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה. תאים העוברים דרך רווח מדידה מתכוונן תצלמו על-ידי המצלמה. האור נכנס לפער מול המצלמה, כלומר התאורה היא על ידי שידור.הגדר את פרמטרי החומרה באמצעות ריכוזי תאים המשתרעים על-פני הטווח הצפוי. התחל לבצע הכנות למדידות לא מקוונות. השתמש במד עובי כדי להתאים את רווח המדידה.לאחר מכן סובבו את אגוז בורג החללית כדי להגדיר את פער המדידה ל-5 או פי 10 מהקטר המרבי הצפוי של התא. במחשב, פתח את תוכנת בקר הבדיקה. בתוכנה, בחר את הבדיקה הרצויה ולעבור לפעולות סעיף.לאחר מכן הקש Connect. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסיה בקרת בדיקה ופתח אותה. התחל הזרמת וידאו על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.תקן את הגשוש חצובה ובצע את השלבים הבאים עבור כל מדידה. עבוד עם הגשוש ותרסס אתנול בפער המדידה. יש לנגב בזהירות כל אבק או לכלוך באמצעות נייר אופטי.במחשב, השתמש בתצוגה חיה כדי לבדוק כי הזכוכית של החיישן הוא ללא חלקיקים. לאחר מכן, מקם נייר אופטי יבש בפער המדידה להתמקדות. סובב את בורג הכריכה כדי להזיז את המוקד באופן ידני.הפסק להתמקד כאשר סיבים בודדים של הנייר בפער המדידה נראים בבירור. עכשיו, קבל צינור מלא במרק תרבות. טובלים את המיקרוסקופ במרק, כך שהפער מכוסה לחלוטין בהשעיית תאים.השתמש בברגים מחייבים כדי לכוונן את המוקד על התאים. לאחר התמקדות זו נעשית, לא לשנות את זה שוב במהלך הניסוי. חזור לתוכנה לניסוי.עבור לתפריט מפעיל. תחת תפריט מפעיל, הגדר את קצב המסגרות. הרץ אחד מומלץ למדידות לא מקוונות.משם, עבור לשדה מסגרות לכל גורם מפעיל והגדר אותו לפי הצורך עבור סטטיסטיקה טובה. הנה, בערך 200. כמו כן, עבור לתפריט כללי.שם, בחר את הספריה שבה יישמרו התמונות. התחל רכישת תמונה באמצעות לחצן התחל רכישת גורם מפעיל של תמונה. הזז בעדינות את הצינור כדי לגרום לזרימה בפער המדידה.השתמש בתמונות מההפעלה הראשונה של הניסוי כסט אימונים. יש את תוכנת קוד פתוח פיג'י מוכן ושחרר את התמונות מהניסוי לתוך החלון שלה. לאחר שתסיים, בחר נתח ולאחר מכן לחץ על כלים ולאחר מכן על מנהל ההשקעות.לאחר מכן, בחרו כלי בחירה. בתמונה, החלט על חלקיק כדי להוסיף ביאורים בפוקוס. צייר עיגול סביבו בעזרת כלי הבחירה.לחץ על הוסף כדי להוסיף את הביאור למנהל ההשקעות. לאחר מכן, בחרו כלי מברשת ובחרו גודל פיקסל מתאים. השתמש בכלי המברשת כדי למקד את הבחירה.המשך לסמן את כל האובייקטים המעניינים באותו אופן בכ- 15 תמונות. שמור את הקבצים המבארים ולהשתמש בהם כסט אימונים. כאשר אלגוריתם הזיהוי מאומן ומוכן, השתמש בו כדי להמחיש תוצאות.במנתח התוצאות, עבור אל קובץ ואחריו ייבוא קובץ. שם, בחר את קובץ התוצאות הרצוי. המשך על-ידי לחיצה על לחצן צור תרשים.בחר תרשים תפוצה. זה יציג את ההתפלגות המורפולוגית של התרבות. חזור אל יצירת תרשים כדי לבחור התוויית רגישות.המידע המוצג יכול לסייע בקביעת מספר התאים שיש לנתח כדי להשיג את הדיוק הרצוי. בצע מדידות מקוונות לאחר השלמת מדידות לא מקוונות. למדידות מקוונות, חבר את הגשוש ישירות לביו-ריירקטור.לאחר ההתחברות, יש לעקר כראוי את ההרכבה. בחר פיקוח בלוח המחוונים. יש כפתור הפעלה כדי להתחיל רכישת תמונה ולחצן עצירה כדי לסיים אותו.לחץ על לחצן ההפעלה. בביו-ריירקט, התחילו לחיסון התרבות. המצלמה תלכוד וידאו של התאים ותזהה אותם באופן אוטומטי לניתוח.הניטור מספק נתונים מקוונים של גדלי תאים וצורות של מורולוגיות תאים שונות במהלך התסיסה כולה. ניתן לעצב את התוצאות בזמן אמת בדרכים שונות וגם לייצא אותן לניתוח נוסף. חלקה זו של התפלגויות מצטברות של קוטר תא S.Cerevisiae נוצרת מנתונים שנותחו באמצעות טכניקה זו.הוא מדגים את זיהוי התאים האוטומטי מסוגל להבחין בין תאים ניצנים ותאים שאינם ניצנים. העקומה המוצקה היא ההתפלגות במהלך הטיפוח בשלוש שעות. העקומה המנוקדת היא התפלגות של אותו טיפוח בשבע שעות.העקומה המקווקות מייצגת נתונים שנאספו ב- 13 שעות. הליך הביאור גוזל זמן רב, אך הוא המפתח להשגת הדיוק הרצוי עבור זיהוי התא. בהליך זה, אם זמני המדידה קצרים יותר מדינמיקת התהליך, ניתן להשתמש במדידה בזמן אמת לבקרת פרוצס.טכניקה זו סוללת את הדרך לשימוש במדידת הטרוגניות האוכלוסייה כפי פרמטר תהליך לגידול מיקרוביאלית מהצעדים המוקדמים של פיתוח תהליכים לקנה מידה של ייצור.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

יוניברסל כף היד תלת ממדי Optoacoustic הדמיה בדיקה לרקמות עמוקות אנגיוגרפיה אדם ופונקציונליים פרה-קליניים מחקרים בזמן אמת

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...