Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Gli autori sono grati per il sostegno del Ministero federale tedesco dell'economia e dell'energia nell'ambito del progetto "Smart Process Inspection", grant no. 4184201CR5.

NOTA: I seguenti passaggi sono necessari per adattare i parametri alle rispettive condizioni di microrganismo e coltura. La regolazione delle impostazioni della sonda dura circa 20 min per un utente esperto. Una descrizione dettagliata degli strumenti e dei passaggi è fornita nel manuale della sonda corrispondente di SOPAT GmbH. In generale, gli strumenti che sono presentati nel seguente protocollo sono necessari: (i) Probe Controller per le regolazioni probe e l'acquisizione dell'immagine; (ii) Figi (Image...

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	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. 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H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. 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M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM come presentato qui con lo stesso o molto simili dispositivi è stato utilizzato per misurare la dinamica morfologica di funghi, microalghe e lieviti, che ha permesso la determinazione dell'attività di crescita, e in caso di alghe, l'accumulo di prodotti intracellulari. Il sensore non ha parti mobili ed è direttamente applicabile in qualsiasi bioreattore di serbatoio agitato standard, sia attraverso una porta standard o in un by-pass sterilizzabile. Poiché il lievito è molto più piccolo delle alghe, la riduzione...

Le caratteristiche morfologiche delle cellule sono spesso legate allo stato fisiologico, esiste una connessione tra forma e funzione per molte applicazioni. La morfologia di una singola cellula è influenzata dallo stato di crescita, dall'età della cellula, dalle sollecitazioni osmotiche e da altre potenziali sollecitazioni cellulari o dall'accumulo di prodotti. I cambiamenti morfologici delle cellule sono spesso una misura della vitalità di crescita di una cultura. Sintesi del prodotto intracellulare, accumulo di lipidi nelle alghe e formazione del corpo di inclusione nei batteri, tra gli altri, sono correlati con la dimensione della cellula pure. L'agglomerazione cellulare può essere un altro fattore che vale la pena indagare come riassunto di recente2.
Le eterogeneità della popolazione possono essere quantificate sulla base delle caratteristiche morfologiche delle singole cellule. Gli studi hanno dimostrato che l'eterogeneità all'interno di una cultura potrebbe essere significativa, ad esempio, in condizioni di produzione su larga scala3 la resa complessiva potrebbe essere influenzata da una bassa performance delle sottopopolazioni4.
Di solito, la valutazione delle caratteristiche morfologiche delle cellule viene eseguita mediante campionamento manuale o con una camera di flusso by-pass accoppiata a un dispositivo foto-ottico. Questo porta a diverse restrizioni: la quantità limitata di dati acquisiti difficilmente può fornire misurazioni statisticamente affidabili; il ritardo tra il campionamento e l'accessibilità dei risultati può essere troppo lungo rispetto alle dinamiche del processo; e, cosa più importante, la procedura di campionamento (posizione della porta di campionamento, pretrattamento del campione prima della misurazione, condizioni sfavorevoli nel tubo di campionamento o bypass) può innescare un errore di parte in quanto la procedura di campionamento stessa può già influenzare la cellula Morfologia. Infine, esiste sempre un alto rischio di contaminazione durante il campionamento o nelle soluzioni by-pass, se non sono sterilizzabili in posizione.
L'applicazione della microscopia in situ (ISM) può aggirare molti di questi problemi. Se le cellule vengono rilevate automaticamente, è possibile esaminare una corretta identificazione delle loro caratteristiche morfologiche5. Fino ad ora, i principali limiti di questo metodo erano (i) il tempo di valutazione delle immagini, che era troppo lungo per le applicazioni in situ, e (ii) la scarsa risoluzione delle immagini, soprattutto ad alta densità di cellule. Sebbene le prime soluzioni di ISM includessero il campionamento meccanico, la diluizione della sonda o fossero limitate a un sistema by-pass6,7, ulteriori approcci consentono l'acquisizione direttamente della sospensione cellulare8.
I recenti progressi nell'ISM consentono il monitoraggio in linea o on line delle cellule su base a singola cellula, che fornisce la distribuzione dei parametri morfologici in tempo reale direttamente nelle sospensioni cellulari a concentrazioni cellulari notevolmente elevate. Attraverso analisi off-line dei parametri chiave delle cellule, è possibile identificare le correlazioni con le informazioni fornite dal rilevamento automatico delle cellule accoppiato e dall'ISM. Quindi, vengono ottenuti nuovi progetti di sensori morbidi, in cui un parametro non misurabile viene stimato con la morfologia a cella singola.
In questo rapporto, l'ISM è condotto acunmando una sonda foto-ottica a un'analisi automatizzata delle immagini. L'ISM è costituito da una sonda sensore a singola asta che consente l'acquisizione di immagini all'interno di un intervallo di messa a fuoco noto in un gap di misura regolabile con una telecamera CCD ad alta risoluzione [MM-Ho - CCD GT2750 (2750x2200) e MM 2.1 - CMOS G507c (2464x2056)]. L'illuminazione della luce flash avviene tramite trasmissione. Pertanto, la luce proviene dal lato opposto della fotocamera9 e la sua intensità può essere regolata. Le cellule passano continuamente attraverso questo divario con il flusso di liquido. Di conseguenza, si ottiene una popolazione campione rappresentativa. La sonda può essere montata direttamente al bioreattore in modo che raggiunga la sospensione cellulare, oppure può essere utilizzata in un by-pass sterilizzabile. Il guscio del sensore è collegato al sistema prima della sterilizzazione, le parti ottiche vengono successivamente montate nel guscio.
Fino ad ora, i microrganismi industriali rilevanti, ad esempioi funghi filamentosi (diametro fino a oltre 200 m), le microalghe eterotrofiche Criptodinium cohnii (diametro medio delle cellule di 20 m), e il lievito Saccharomyces cerevisiae (diametro medio delle cellule di 5 m), sono stati studiati con questo o dispositivi simili, che è brevemente descritto.
I funghi filamentosi tendono a formare pellet in determinate condizioni di coltivazione. Questi sono di una dimensione di diverse centinaia di m. Le ife delle cellule fungine sviluppano diverse lunghezze di dipendenza dallo stress idrodinamico nella fase fluida. Questo ha un'influenza sull'attività metabolica e di crescita, l'assorbimento del substrato e il rilascio del prodotto. ISM è stato applicato per identificare la distribuzione delle dimensioni del pellet e la larghezza delle zone di minore densità di biomassa ai bordi dei pellet (dati inediti).
La dimensione di C. cohnii cambia tra 15 e 26 m quando le cellule accumulano l'acido grasso polinsaturico docosaexaenoico acido (DHA) sotto limiti di azoto. Questo processo di produzione di DHA biotecnologico è costituito da due parti, la fase di crescita, in cui le cellule si dividono e diventano più piccole, e la fase di produzione, in cui le cellule accumulano il prodotto e quindi diventano più grandi. Pertanto, la dimensione della cella è stata utilizzata per determinare lo stato del processo, in cui la crescita o la produzione di DHA era favorevole. Infine, è stata trovata una correlazione tra la dimensione della cella e il contenuto DHA. In questo caso, ISM permette di monitorare l'accumulo di DHA intracellulare in tempo reale senza il requisito di campionamento, interruzione delle cellule, e l'analisi cromatografia gas comune10.
Il lievito di busparazione è di solito di dimensioni comprese tra 3 e 8 m. La percentuale di cellule che sono nello stato di maturazione alla volta, come descritto con l'indice in erba (BI), fornisce informazioni sulla vitalità della crescita11,12, e anche una relazione con la secrezione proteica ricombinante è stata dimostrata13. Con l'aiuto di ISM, le cellule di lievito in erba e non in erba (cellule con e senza gemme) si sono distinte14. Le condizioni di stress possono anche portare a una variazione più ampia delle dimensioni delle cellule all'interno di una popolazione di lieviti, come recentemente mostrato nelle coltivazioni scale-down, in cui le condizioni di coltivazioni alimentate con limitato nutrimento su larga scala sono state imitate3.
Pertanto, ISM ha il potenziale per monitorare la vitalità della crescita e la formazione del prodotto a livello di singola cellula durante tutte le fasi di un bioprocesso per l'identificazione di condizioni di coltivazione ottimali o ai fini del controllo dei processi. I metodi qui descritti si concentrano sulle applicazioni microbiche con singole cellule, ma sono applicabili anche a particelle più grandi come cellule umane e animali, agglomerati cellulari e pellet di organismi mentosi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

Il monitoraggio in situ nei bioprocessi microbici è per lo più limitato alle proprietà chimiche e fisiche del mezzo(ad esempio,il valore di pH e la concentrazione di ossigeno disciolto). Tuttavia, la morfologia delle cellule può essere un indicatore adatto per condizioni ottimali, poiché cambia con la dipendenza dallo stato di crescita, l'accumulo di prodotto e lo stress cellulare. Inoltre, la distribuzione delle dimensioni delle singole cellule fornisce non solo informazioni sulle condizioni di coltivazione, ma anche sull'eterogeneità della popolazione. Per ottenere tali informazioni, è stato sviluppato un dispositivo di microscopia in situ foto-ottico1 per consentire il monitoraggio della distribuzione delle dimensioni delle singole cellule direttamente nelle sospensioni cellulari nei bioreattori. Un'analisi automatizzata delle immagini viene accoppiata alla microscopia basata su un modello di rete neurale, sottoposto a training con immagini con annotato dall'utente. Diversi parametri, che si ottengono dalle catture del microscopio, sono correlati per elaborare le caratteristiche rilevanti delle cellule, come la loro attività metabolica. Fino ad ora, la serie di sonde di microscopia in situ è stata applicata per misurare la dimensione del pellet nelle sospensioni filamentose dei funghi. È stato utilizzato per distinguere le dimensioni delle singole cellule nella coltivazione delle microalghe e metterle in relazione con l'accumulo di lipidi. La forma delle particelle cellulari era correlata al germogliamento nelle colture di lievito. L'analisi della microscopia può essere generalmente suddivisa in tre fasi: (i) acquisizione di immagini, (ii) identificazione delle particelle e (iii) analisi dei dati, rispettivamente. Tutte le misure devono essere adattate all'organismo, e quindi sono necessarie informazioni specifiche con annotato per ottenere risultati affidabili. La capacità di monitorare i cambiamenti nella morfologia cellulare direttamente in linea o on line (in un by-pass) consente valori in tempo reale per il monitoraggio e il controllo, nello sviluppo dei processi e nella scala di produzione. Se i dati off line sono correlati ai dati in tempo reale, le misurazioni off line correnti con influenze sconosciute sulla dimensione della cellula diventano inutili.

Il rilevamento delle dimensioni delle cellule nelle colture di lievito con l'ISM e il rilevamento automatico delle immagini per distinguere tra cellule in erba e non in erba è stato condotto con successo. Sia l'intensità dello stroboscopio che la scelta del divario di misurazione hanno una gamma di tolleranza, in cui l'identificazione delle particelle non è influenzata. Ad esempio, le cellule di S. cerevisiae sono state misurate con varie intensità dello stroboscopio all'inte...

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In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

È stato sviluppato un dispositivo di microscopia foto-ottica in situ per monitorare le dimensioni delle singole cellule direttamente nella sospensione cellulare. La misurazione in tempo reale viene effettuata accolando la sonda sterilizzabile fotoottica a un'analisi automatizzata delle immagini. I cambiamenti morfologici compaiono con dipendenza dallo stato di crescita e dalle condizioni di coltivazione.

In Situ Microscopia per la determinazione in tempo reale della morfologia a singola cellula nei bioprocessi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave sull'eterogeneità della popolazione attraverso la valutazione morfologica delle cellule. La microscopia in situ consente di studiare le condizioni di coltivazione, le rese di processo e la qualità del prodotto. Il principale vantaggio di questa tecnica è una misurazione in situ, che fornisce dati in tempo reale senza campionamento o portando rischio di contaminazione.La microscopia in situ abbinata al riconoscimento automatico delle immagini può fornire ulteriori informazioni sulle strutture cellulari, la forma e l'agglomerazione cellulare oltre le dimensioni. È anche possibile misurare le concentrazioni cellulari. Il metodo si è dimostrato uno strumento affidabile.Nessun metodo alternativo fornisce le stesse informazioni in così poco tempo e basso sforzo per la preparazione del campione. Il metodo è stato adattato a vari bioprocessi e microrganismi, funghi filamentosi SEG, micro-allergia e lievito. La sonda viene utilizzata in combinazione con un computer.L'hardware è costituito da una singola sonda ad asta con una telecamera CCD ad alta risoluzione. Le celle che passano attraverso uno spazio di misurazione regolabile vengono immagini dalla fotocamera. La luce entra nello spazio di fronte alla fotocamera, il che significa che l'illuminazione è tramite trasmissione.Impostare i parametri hardware utilizzando concentrazioni di celle che si estendono sull'intervallo previsto. Inizia a preparare le misurazioni offline. Utilizzare uno spessore per regolare lo spazio di misura.Quindi ruotare il dado della vite della sonda per impostare lo spazio di misurazione su cinque o 10 volte il diametro massimo previsto della cella. Al computer aprire il software del controller della sonda. Nel software, selezionare la sonda desiderata e passare alle azioni di sezione.Quindi premere Connetti. Passare quindi alla scheda Controllo probe e aprirla. Avvia lo streaming video premendo il pulsante riproduci.Fissare la sonda a un treppiede ed eseguire i seguenti passaggi per ogni misurazione. Lavorare con la sonda e spruzzare etanolo nello spazio di misurazione. Pulire con cura la polvere o lo sporco con carta ottica.Al computer, utilizzare la vista dal vivo per verificare che il vetro del sensore sia privo di particelle. Quindi, posizionare una carta ottica asciutta nello spazio di misurazione per la messa a fuoco. Ruotare la vite di attacco per spostare manualmente la messa a fuoco.Interrompere la messa a fuoco quando le singole fibre della carta nello spazio di misurazione sono chiaramente visibili. Ora, prendi un tubo pieno di brodo di cultura. Immergere il microscopio nel brodo, in modo che lo spazio sia completamente coperto da sospensione cellulare.Utilizzare le viti di attacco per ottimizzare la messa a fuoco sulle celle. Una volta terminata questa messa a fuoco, non cambiarla di nuovo durante l'esperimento. Tornare al software per l'esperimento.Passare al menu Attivazione. Nel menu Attivazione impostare la frequenza fotogrammi. Un hertz è consigliato per le misurazioni offline.Da lì, vai al campo Fotogrammi per trigger e impostalo se necessario per buone statistiche. Qui, circa 200. Inoltre, vai al menu Generale.Lì, seleziona la directory in cui verranno salvate le immagini. Inizia l'acquisizione dell'immagine con il pulsante Avvia acquisizione trigger immagine. Spostare delicatamente il tubo per indurre il flusso nello spazio di misurazione.Utilizzare le immagini della prima esecuzione dell'esperimento come set di training. Fai preparare il software open source Fiji e rilascia le immagini dall'esperimento nella sua finestra. Al termine, selezionare Analizza, seguito da Strumenti, quindi ROI Manager.Scegliere quindi uno strumento di selezione. Nell'immagine, decidi su una particella per annotare che è a fuoco. Disegna un cerchio intorno ad esso con lo strumento di selezione.Premere Aggiungi per aggiungere l'annotazione a Gestione ROI. Selezionare quindi uno strumento pennello e scegliere una dimensione in pixel appropriata. Utilizzare lo strumento pennello per perfezionare la selezione.Continua a contrassegnare tutti gli oggetti di interesse allo stesso modo su circa 15 immagini. Salvare i file annotati e utilizzarli come set di training. Quando l'algoritmo di riconoscimento viene sottoposto a training e pronto, utilizzarlo per visualizzare i risultati.In Analizzatore risultati passare a File, seguito da Importa file. Lì, selezionare il file dei risultati desiderato. Continuare premendo il pulsante Crea grafico.Selezionare Grafico distribuzione. Questo mostrerà la distribuzione morfologica della cultura. Tornate a Crea grafico (Create Chart) per selezionare Tracciato sensibilità (Sensitivity Plot).Le informazioni visualizzate possono aiutare a determinare quante celle devono essere analizzate per ottenere l'accuratezza desiderata. Eseguire misurazioni online dopo aver completato le misurazioni offline. Per le misurazioni online, collegare la sonda direttamente a un bioreattore.Una volta collegato, sterilizzare correttamente l'assemblaggio. Selezionare Monitoraggio nel dashboard. C'è un pulsante di riproduzione per avviare l'acquisizione dell'immagine e un pulsante di arresto per terminarla.Premere il pulsante di riproduzione. Al bioreattore, inizia l'inoculazione della cultura. La fotocamera acquisirà il video delle celle e le identificherà automaticamente per l'analisi.Il monitoraggio fornisce dati online di dimensioni cellulari e forme di diverse morfologie cellulari durante l'intera fermentazione. I risultati in tempo reale possono essere formattati in vari modi e anche esportati per ulteriori analisi. Questo grafico delle distribuzioni cumulative del diametro della cella di S.Cerevisiae viene creato dai dati analizzati utilizzando questa tecnica.Dimostra che il riconoscimento automatico delle celle è in grado di distinguere le cellule in erba e non in erba. La curva solida è la distribuzione durante una coltivazione a tre ore. La curva punteggiata è la distribuzione della stessa coltivazione a sette ore.La curva tratteggiata rappresenta i dati raccolti a 13 ore. La procedura di annotazione richiede molto tempo, ma è la chiave per ottenere l'accuratezza desiderata per l'identificazione delle celle. Con questa procedura, se i tempi di misurazione sono più brevi della dinamica di processo, la misurazione in tempo reale può essere utilizzata per il controllo del processo.Questa tecnica apre la strada all'utilizzo della misurazione dell'eterogeneità della popolazione come parametro di processo per le coltivazioni microbiche dalle prime fasi di sviluppo del processo alla scala di produzione.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Ricerca

Bioingegneria

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universale Mano libera tridimensionale optoacustica Imaging Probe per Deep Tissue angiografia umana e funzionali studi preclinici in tempo reale

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...