Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
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저자는 프레임 워크 ZIM-Koop 내에서 독일 연방 경제 에너지부의 지원에 감사드립니다, 프로젝트 "스마트 프로세스 검사", 부여 없음. ZF 4184201CR5.

참고: 다음 단계는 각각의 미생물 및 배양 조건에 매개변수를 적용하는 데 필요하다. 프로브 설정 조정은 숙련된 사용자에게 약 20분 동안 지속됩니다. 도구 및 단계에 대한 자세한 설명은 SOPAT GmbH의 해당 프로브 매뉴얼에 제공됩니다. 일반적으로, 다음 프로토콜에 제시되는 도구가 필요합니다: (i) 프로브 조정 및 이미지 수집을 위한 프로브 컨트롤러; (ii) 획득 한 이미지에 대한 주석피지 <em...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. 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L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

여기에 제시된 ISM은 동일하거나 매우 유사한 장치로 곰팡이, 미세 조류 및 효모 세포의 형태학적 역학을 측정하는 데 사용되었으며, 이는 성장 활성의 측정을 가능하게 하고, 조류의 경우, 세포내 제품 축적을 가능하게 하였다. 이 센서는 이동식 부품이 없으며 표준 포트를 통해 또는 멸균 가능한 바이패스로 표준 교반 탱크 생물 반응기에 직접 적용할 수 있습니다. 효모는 조류보다 훨씬 작기 때?...

세포의 형태학적 특징은 종종 생리적 상태와 관련이 있으며, 형태와 기능 사이의 연관성은 많은 응용에 존재한다. 단일 세포의 형태는 성장 상태, 세포의 나이, 삼투성 및 기타 잠재적 인 세포 스트레스 또는 제품 축적에 의해 영향을받습니다. 세포의 형태학적 변화는 종종 배양의 성장 활력의 척도이다. 세포 내 제품 합성, 조류에 지질 축적 및 박테리아에 포함 신체 형성, 다른 사람의 사이에서, 뿐만 아니라 세포 크기와 관련. 세포 응집은 최근 요약 된 바와 같이 조사 가치가 또 다른 요인이 될 수 있습니다2.
집단 이질성은 개별 세포의 형태학적 특징에 기초하여 정량화될 수 있다. 연구 결과에 따르면 배양 내의 이질성은 유의할 수 있으며, 예를 들어대규모 생산조건 3하에서 전체 수율은 하위 모집단4의낮은 성능에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
일반적으로, 세포의 형태학적 특징의 평가는 수동 샘플링 또는 광 광학 장치에 결합된 바이패스 플로우 챔버로 수행된다. 이것은 몇 가지 제한으로 이어진다 : 획득 된 데이터의 제한된 양은 거의 통계적으로 신뢰할 수있는 측정을 제공 할 수 없습니다; 샘플링과 결과의 접근성 사이의 시간 지연은 프로세스의 역학에 비해 너무 길 수 있습니다. 그리고 가장 중요한 것은 샘플링 절차 (샘플링 포트의 위치, 측정 전에 샘플의 전처리, 샘플링 또는 우회 튜브의 불리한 조건)는 샘플 절차 자체가 이미 셀에 영향을 미칠 수 있기 때문에 편향된 오류를 유발할 수 있습니다. 형태학. 마지막으로, 샘플링 중 또는 바이패스 솔루션에서 멸균이 불가능한 경우 항상 오염 위험이 높습니다.
SITU 현미경 검사법 (ISM)의 적용은 이러한 문제 중 몇 가지를 우회 할 수 있습니다. 세포가 자동으로 감지되면 형태학적 특징의 정확한 식별을 조사할 수 있습니다5. 지금까지이 방법의 주요 제한 사항은 (i) 현장에서 너무 길었던 이미지의 평가 시간, 그리고 (ii) 특히 높은 세포 밀도에서 이미지의 잘못된 해상도였습니다. ISM의 첫 번째 솔루션은 기계적 샘플링, 프로브의 희석, 또는 바이 패스 시스템6,7로제한되었지만, 추가 접근법은 셀 서스펜션을 직접8로캡처할 수 있게 한다.
ISM의 최근 발전은 단일 세포 기준으로 세포의 인라인 또는 라인 모니터링을 허용하며, 이는 상당히 높은 세포 농도에서 세포 현탁액에서 직접 실시간으로 형태학적 매개 변수의 분포를 제공합니다. 셀의 주요 매개 변수에 대한 오프라인 분석을 통해 결합된 자동 셀 검출 및 ISM에서 제공하는 정보와의 상관 관계를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 단일 셀 형태로 측정 할 수없는 매개 변수를 추정하는 새로운 소프트 센서 설계가 달성됩니다.
이 보고서에서 ISM은 광 광학 프로브를 자동화된 이미지 분석에 결합하여 수행됩니다. ISM은 고해상도 CCD 카메라[MM-Ho = CCD GT2750(2750x2200) 및 MM 2.1 = CMOS G507c(2464x2056)]로 조정 가능한 측정 갭에서 알려진 초점 범위 내에서 이미지를 캡처할 수 있는 단일 로드 센서 프로브로 구성됩니다. 플래시 라이트 조명은 전송에 의해 수행됩니다. 따라서 라이트는 카메라9의 반대쪽에서 발생하며 강도를 조정할 수 있습니다. 세포는 액체 흐름과 이 간격을 연속하여 통과합니다. 따라서 대표적인 샘플 채우기가 수득됩니다. 프로브는 바이오리액터에 직접 장착하여 세포 현탁액에 도달하거나 멸균 가능한 바이패스로 사용할 수 있습니다. 센서 쉘은 멸균 전에 시스템에 연결되고, 광학 부품은 이후에 쉘에 장착됩니다.
지금까지, 관련 산업 미생물, 예를 들면,필라멘트 균류 (최대 200 μm의 직경), 이종 영양 미세 조류 크립토 페코디늄 cohnii (20 μm의 평균 세포 직경), 및 효모 Saccharomyces cerevisae (5 μm의 평균 세포 직경) 곧 이와 유사한 장치로 조사되었다.
필라멘트 균류는 특정 재배 조건 하에서 펠릿을 형성하는 경향이있다. 이들은 수백 μm까지의 크기입니다. 곰팡이 세포의 하이픈은 유체 단계에서 유체 역학 적 스트레스에 의존하여 서로 다른 길이를 개발합니다. 이것은 신진 대사 및 성장 활동, 기질 섭취 및 제품 방출에 영향을 미칩니다. ISM은 펠릿 의 가장자리에서 낮은 바이오 매스 밀도의 영역의 펠릿 크기 분포 및 폭을 식별하기 위해 적용되었다 (자신의 미공개 데이터).
C. cohnii의 크기는 세포가 질소 제한의 밑에 고도 불포화 지방산 docosahexaenoic 산 (DHA)를 축적할 때 15 그리고 26 μm 사이에서 변경합니다. 이 생명 공학 DHA 생산 과정은 세포가 분열하고 작아지는 성장 단계와 세포가 제품을 축적하여 더 커지는 생산 단계의 두 부분으로 구성됩니다. 따라서, 세포 크기는 성장 또는 DHA 생산이 유리한 공정 상태를 결정하는데 사용되었다. 마지막으로, 세포 크기와 DHA 함량 사이의 상관관계가 발견되었다. 이 경우 ISM은 샘플링, 세포 파괴 및 일반적인 가스 크로마토그래피 분석10의요구 없이 세포내 DHA 축적을 실시간으로 모니터링할 수 있다.
신진 효모는 일반적으로 3 ~ 8 μm 사이의 크기입니다. 신진지수(BI)와 같이 한 번에 성숙 상태에 있는 세포의 비율은, 성장 활력에 대한 정보를 제공하는11,12,및 재조합 단백질 분비와의 관계도13으로입증되었다. ISM의 도움으로, 신진 및 비 신진 효모 세포 (싹이있는 세포와 싹이없는세포)는 14를구별했습니다. 스트레스 조건은 또한 효모 인구 내의 세포 크기의 더 넓은 변화로 이끌어 낼 수 있습니다, 최근 스케일 다운 재배에서 나타난 바와 같이, 있는 대규모 영양소 제한 공급 배치 재배의 조건은 모방되었다3.
따라서 ISM은 최적의 재배 조건을 식별하거나 공정 제어를 목적으로 하는 생물공정의 모든 단계에서 단일 세포 수준에서 성장 활력 및 생성물 형성을 모니터링할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 여기에서 기술한 방법은 단 하나 세포를 가진 미생물 응용에 집중됩니다, 그러나 또한 인간과 동물 세포, 세포 응집체 및 필라멘트 유기체의 펠릿 같이 더 큰 입자에 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

미생물 바이오공정에서의 상시 모니터링은 주로 배지의 화학적 및 물리적특성(예를 들어,pH 값 및 용존 산소 농도)으로 제한된다. 그럼에도 불구하고, 세포의 형태는 성장 상태, 제품 축적 및 세포 스트레스에 의존하여 변화하기 때문에 최적의 조건에 적합한 지표가 될 수 있습니다. 더욱이, 단세포 크기 분포는 재배 조건에 대한 정보뿐만 아니라 인구 이질성에 대한 정보도 제공한다. 이러한 정보를 얻기 위해, 광-광학 적 현미경 장치1은 생물 반응기에서 세포 현탁액에서 직접 단일 세포 크기 분포의 모니터링을 가능하게하기 위해 개발되었다. 자동화된 이미지 분석은 사용자가 추가한 이미지로 학습되는 신경망 모델을 기반으로 현미경 검사법에 결합됩니다. 현미경의 포획에서 얻은 몇몇 매개변수는, 그들의 신진 대사 활동 같이 세포의 관련 특징을 처리하기 위하여 상관됩니다. 지금까지, 실라멘트 균주 현탁액에서 펠릿 크기를 측정하기 위해 시투 현미경 프로브 시리즈에 제시되었다. 미세조류 재배에서 단세포 크기를 구별하고 지질 축적과 관련시키기 위해 사용되었다. 세포 입자의 모양은 효모 배양에서 신진과 관련이 있었습니다. 현미경 분석은 일반적으로 세 단계로 분할 될 수있다: (i) 이미지 수집, (ii) 입자 식별, 및 (iii) 데이터 분석, 각각. 모든 단계는 유기체에 적응되어야하며, 따라서 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 특정 추가 정보가 필요합니다. 라인 또는 라인(바이패스)에서 세포 형태학의 변화를 직접 모니터링하는 기능을 통해 공정 개발 및 생산 규모에서 모니터링 및 제어를 위한 실시간 값을 구현할 수 있습니다. 오프라인 데이터가 실시간 데이터와 상관 관계가 있는 경우 셀 크기에 대한 알 수 없는 영향을 미치는 현재의 지루한 오프라인 측정은 불필요하게 됩니다.

ISM을 사용하여 효모 배양에서 세포 크기 검출을 성공적으로 수행하였고, 신진 세포와 비신진 세포를 구별하기 위한 자동화된 이미지 검출이 성공적으로 수행되었다. 스트로보스코프 강도와 측정 갭의 선택은 모두 입자 식별에 영향을 미치지 않는 허용 오차 범위를 갖습니다. 예를 들어, S. 세레비시아세포는 4 gL-1의건조한 바이오매스 농도에서 11%의 변이 범...

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In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

현미경 검사기 에서 광 광학 은 세포 현탁액에서 직접 단일 세포의 크기를 모니터링하기 위해 개발되었다. 실시간 측정은 광 광학 멸균 프로브를 자동화된 이미지 분석에 결합하여 수행됩니다. 형태학적 변화는 성장 상태 및 재배 조건에 의존하여 나타납니다.

시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

이 방법은 세포의 형태학적 평가를 통해 인구 이질성의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시투 현미경 검사에서는 연구 재배 조건, 공정 수율 및 제품 품질을 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플링하거나 오염의 위험을 초래하지 않고 실시간 데이터를 제공하는 내부 측정입니다.자동화된 이미지 인식과 결합된 시투 현미경 검사에서는 크기 이상의 세포 구조, 모양 및 세포 응고에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다. 세포 농도를 측정할 수도 있습니다. 이 방법은 신뢰할 수있는 도구로 입증되었습니다.샘플 준비를 위한 짧은 시간 및 낮은 노력으로 동일한 정보를 제공하는 대체 방법은 없습니다. 이 방법은 다양한 생체 공정 및 미생물, SEG 필라멘트 균류, 미생물 알레르기 및 효모에 적응되었습니다. 프로브는 컴퓨터와 함께 사용됩니다.하드웨어는 고해상도 CCD 카메라가 있는 단일 로드 프로브로 구성됩니다. 조정 가능한 측정 간격을 통과하는 셀은 카메라로 이미지됩니다. 빛이 카메라 맞은편 틈새에 들어오므로 조명은 전송에 의한 것입니다.예상 범위에 걸쳐 셀 농도를 사용하여 하드웨어 매개 변수를 설정합니다. 오프라인 측정준비를 시작하십시오. 두께 게이지를 사용하여 측정 간격을 조정합니다.그런 다음 프로브 나사 너트를 돌려 측정 간격을 최대 예상 셀 직경의 5 배 또는 10 배로 설정합니다. 컴퓨터에서 프로브 컨트롤러 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어에서 원하는 프로브를 선택하고 섹션 작업으로 이동합니다.그런 다음 연결을 누릅니다. 그런 다음 프로브 컨트롤 탭으로 이동하여 엽니다. 재생 버튼을 눌러 비디오 스트리밍을 시작합니다.프로브를 삼각대에 고정하고 각 측정에 대해 다음 단계를 수행합니다. 측정 갭에서 프로브와 스프레이 에탄올과 함께 작업합니다. 광학 용지로 먼지나 먼지를 조심스럽게 닦으시다.컴퓨터에서 라이브 뷰를 사용하여 센서 의 유리가 입자가 없는지 확인합니다. 다음으로, 집중을 위한 측정 갭에 건식 광학 용지를 놓습니다. 바인딩 나사를 돌려 포커스를 수동으로 이동합니다.측정 갭에서 종이의 단일 섬유가 명확하게 볼 때 초점을 중지합니다. 이제 문화 국물로 가득 찬 튜브를 얻으십시오. 국물에 현미경을 찍어, 그래서 간격은 완전히 세포 현탁액으로 덮여있다.바인딩 나사를 사용하여 셀에 초점을 미세 조정합니다. 이 초점 작업이 완료되면 실험 중에 다시 변경하지 마십시오. 실험을 위해 소프트웨어로 돌아갑니다.트리거링 메뉴로 이동합니다. 트리거링 메뉴에서 프레임 속도를 설정합니다. 오프라인 측정에 헤르츠 1개를 권장합니다.거기에서 트리거당 프레임 필드로 이동하여 좋은 통계에 필요한 대로 설정합니다. 여기, 약 200. 또한 일반 메뉴로 이동합니다.거기에서 이미지가 저장되는 디렉토리를 선택합니다. 이미지 트리거 수집 시작 버튼으로 이미지 수집을 시작합니다. 튜브를 부드럽게 움직이면 측정 갭의 흐름을 유도합니다.실험의 첫 번째 실행에서 이미지를 학습 세트로 사용합니다. 오픈 소스 소프트웨어 피지 준비 하 고 창에 실험에서 이미지를 드롭. 완료되면 분석한 다음 도구, ROI 관리자를 선택합니다.다음으로 선택 도구를 선택합니다. 이미지에서 포커스가 있는 에추가 새기도록 파티클을 결정합니다. 선택 도구를 사용하여 원을 그립니다.추가를 눌러 ROI 관리자에 추가합니다. 다음으로 브러시 도구를 선택하고 적절한 픽셀 크기를 선택합니다. 브러시 도구를 사용하여 선택 영역을 구체화합니다.약 15개의 이미지에서 관심 있는 모든 개체를 동일한 방식으로 계속 표시합니다. 추가 된 파일을 저장하고 교육 세트로 사용합니다. 인식 알고리즘이 학습되고 준비되면 이를 사용하여 결과를 시각화합니다.결과 분석기에서 파일로 이동한 다음 가져오기 파일이 표시됩니다. 거기에서 원하는 결과 파일을 선택합니다. 차트 만들기 단추를 눌러 계속합니다.배포 차트를 선택합니다. 이렇게 하면 배양물의 형태학적 분포가 표시됩니다. 차트 만들기로 돌아가 감도 플롯을 선택합니다.표시된 정보는 원하는 정확도를 얻기 위해 분석해야 하는 셀 수를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오프라인 측정을 완료한 후 온라인 측정을 수행합니다. 온라인 측정을 위해 프로브를 생물 반응기에 직접 연결합니다.일단 연결되면 어셈블리를 적절하게 소독합니다. 대시보드에서 모니터링을 선택합니다. 이미지 수집을 시작하는 재생 버튼과 종료할 중지 버튼이 있습니다.재생 버튼을 누릅니다. 생물 반응기에서, 문화의 접종을 시작합니다. 카메라는 셀비디오를 캡처하고 분석을 위해 자동으로 식별합니다.모니터링은 전체 발효 중에 셀 크기와 다른 세포 형태의 모양의 온라인 데이터를 제공합니다. 실시간 결과를 다양한 방법으로 포맷할 수 있으며 추가 분석을 위해 내보낼 수도 있습니다. S.Cerevisiae 세포 직경의 누적 분포의 이 플롯은 이 기술을 사용하여 분석된 데이터에서 생성됩니다.그것은 자동 세포 인식이 신진 및 비 신진 세포를 구별 할 수 있음을 보여줍니다. 솔리드 커브는 재배 중 3시간 동안 분포된다. 점선 곡선은 7시간 동안 동일한 재배의 분포입니다.대시 곡선은 13시간 동안 수집된 데이터를 나타냅니다. 기여 절차는 시간이 많이 걸리지만 셀 식별에 필요한 정확도를 달성하는 것이 중요합니다. 이 절차를 사용하면 측정 시간이 공정 역학보다 짧은 경우 실시간 측정을 공정 제어에 사용할 수 있습니다.이 기술은 초기 공정 개발 단계에서 생산 규모까지 미생물 재배를 위한 공정 파라미터로서 인구 이질성의 측정을 사용하는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

범용 실시간으로 깊은 조직 인간의 혈관 조영술과 기능 전임상 연구를위한 3 차원 광 음향 이미징 프로브를 손 개최

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...