Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Forfatterne er takknemlig for støtte fra det tyske føderale departementet for økonomi og energi innenfor rammeverket ZIM-Koop, prosjektet "Smart Process inspeksjon", gi nei. ZF 4184201CR5.

Merk: følgende trinn er nødvendige for å tilpasse parametrene til de respektive mikroorganismen og kultur forhold. Justeringen av sonde innstillingene varer ca 20 min for en erfaren bruker. En detaljert beskrivelse av verktøy og trinn er gitt i den korresponderende sonde manualen fra SOPAT GmbH. Generelt er verktøyene som presenteres i følgende protokoll nødvendig: (i) probe Controller for sonde justeringer og bildeoppkjøp; (II) Fiji (ImageJ) for kommentarer på ervervet bilder; (III) SOPAT ...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM som presenteres her med samme eller svært like enheter ble brukt til å måle morfologiske dynamikk av sopp, mikroalger, og gjærceller, som gjorde det mulig fastsettelse av vekst aktivitet, og i tilfelle av alger, intracellulære produkt akkumulering. Sensoren har ingen bevegelige deler og er direkte anvendelig i enhver standard rørt tank bioreactor, enten gjennom en standard port eller i en vanndampsteriliseres by-pass. Siden gjær er mye mindre enn alger, reduksjonen i Cellestørrelse kreves noen nyere maskinvar...

Morfologiske funksjoner av celler er ofte knyttet til den fysiologiske tilstand, en forbindelse mellom form og funksjon finnes for mange programmer. Morfologi av en enkelt celle er påvirket av tilstanden til vekst, cellens alder, osmotisk og andre potensielle celle påkjenninger eller produkt akkumulering. Morfologiske endringer av celler er ofte et mål på vekst vitalitet i en kultur. Intracellulære produkt syntese, lipid akkumulering i alger og inkludering kroppens dannelse i bakterier, blant andre, er i slekt med cellestørrelsen også. Cell agglomerering kan være en annen faktor som er verdt å undersøke som oppsummert nylig2.
Befolknings heterogeniteter kan være kvantifisert basert på morfologiske trekk ved individuelle celler. Studier viste at heterogenitet innenfor en kultur kan være betydelig, for eksempelunder store produksjonsforhold3 den totale avkastningen kan påvirkes av en lav ytelse av subpopulasjoner4.
Vanligvis er vurderingen av morfologiske funksjoner av celler utført av manuell prøvetaking eller med en by-pass Flow kammer koplet til en foto-optisk enhet. Dette fører til flere restriksjoner: den begrensede mengden ervervet data kan neppe gi statistisk pålitelige målinger; tidsforsinkelsen mellom prøvetaking og tilgjengeligheten av resultatene kan være for lang i forhold til dynamikken i prosessen; og viktigst, prøvetaking prosedyren (plassering av prøvetaking porten, pre-behandling av prøven før målingen, ugunstige forhold i prøvetaking eller bypass tube) kan utløse en partisk feil som prøven prosedyren i seg selv kan allerede påvirke celle Morfologi. Til slutt, det finnes alltid en høy risiko for forurensning under prøvetaking eller i by-pass løsninger, hvis de ikke er vanndampsteriliseres på plass.
Anvendelsen av in situ MIKROSKOPI (ISM) kan omgå flere av disse problemene. Hvis celler oppdages automatisk, kan en korrekt identifisering av deres morfologiske funksjoner bli kartlagt5. Hittil var de viktigste begrensningene ved denne metoden (i) evaluerings tidspunktet for bilder, som var for lang for in situ -applikasjoner, og (II) den dårlige oppløsningen av bilder, spesielt ved høy celle tetthet. Selv om første løsninger av ISM inkluderte mekanisk prøvetaking, fortynning av sonden, eller var begrenset til et by-pass system6,7, ytterligere tilnærminger tillate fangst av cellen suspensjon direkte8.
Nylige fremskritt i ISM gir mulighet for in line eller on line overvåking av celler på en enkelt celle basis, som gir fordelingen av morfologiske parametre i sanntid direkte i celle suspensjoner ved betydelig høye celle konsentrasjoner. Gjennom off linje analyser av cellenes nøkkelparametre, sammenhenger med informasjon gitt av sammenkoblede automatiserte celle deteksjon og ISM kan identifiseres. Deretter oppnås nye Soft sensor design, der en unmeasurable parameter er anslått med enkelt celle morfologi.
I denne rapporten utføres ISM ved å kopling en foto-optisk sonde til en automatisert bildeanalyse. ISM består av en enkelt stang sensor sonde som gjør det mulig å fange opp bilder innenfor et kjent fokusområde i et justerbart mål gap med et høyoppløselig CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) og MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Blits lys belysningen utføres ved overføring. Derfor kommer lyset fra motsatt side av kameraet9 og dens intensitet kan justeres. Celler passerer kontinuerlig gjennom dette gapet med væsken flyt. Derfor oppnås en representativ utvalgs populasjon. Sonden kan monteres direkte på bioreactor slik at den når inn i celle fjæringen, eller den kan brukes i en vanndampsteriliseres by-pass. Sensor skallet er koblet til systemet før sterilisering, de optiske delene er etterpå montert inn i skallet.
Inntil nå, relevante industrielle mikroorganismer, f. eks, trådformede sopp (diameter på opptil over 200 μm), heterotrofe mikroalger Crypthecodinium cohnii (gjennomsnittlig celle diameter på 20 μm), og gjær Saccharomyces cerevisiae (gjennomsnittlig celle diameter på 5 μm), ble undersøkt med denne eller lignende enheter, som er kort beskrevet.
Trådformede sopp tendens til å danne pellets under visse dyrking forhold. Disse er av en størrelse på opp til flere hundre μm. Hyfer av sopp cellene utvikle ulike lengder i avhengighet til hydrodynamisk stress i væskefasen. Dette har en innflytelse på metabolsk og vekst aktivitet, substrat opptak og produkt utgivelse. ISM ble brukt til å identifisere pellet størrelsesfordelingen og bredden av soner av lavere biomasse tetthet på kantene av pellets (egne upubliserte data).
Størrelsen på C. cohnii endrer mellom 15 og 26 μm når cellene akkumuleres flerumettede fatty acid dokosaheksaensyre acid (DHA) under nitrogen begrensning. Denne bioteknologisk DHA produksjonsprosessen består av to deler, vekstfasen, der cellene deler seg og blir mindre, og produksjonsfasen, der cellene akkumulerer produktet og dermed blir større. Derfor ble cellestørrelsen brukt til å bestemme prosess tilstanden, der enten vekst eller DHA-produksjon var gunstig. Til slutt ble det funnet en korrelasjon mellom cellestørrelsen og DHA-innholdet. I dette tilfellet gjør ISM det mulig å overvåke den intracellulære DHA-akkumulering i sanntid uten kravet om prøvetaking, celle avbrudd og felles gass kromatografi analyse10.
Spirende gjær er vanligvis av en størrelse mellom 3 og 8 μm. Andelen celler som er i modnings tilstand om gangen, som beskrevet med den spirende index (BI), gir informasjon om vekst vitalitet11,12, og selv en forbindelse med rekombinant protein sekresjon er påvist13. Med hjelp av ISM var spirende og ikke-spirende gjærceller (celler med og uten en knopp) fremtredende14. Stress forhold kan også føre til en bredere variant av cellestørrelsen i en gjær befolkning, som nylig vist i skala ned dyrket, der forholdene i storstilt nærings-begrenset matet-batch dyrket var etterlignet3.
Derfor har ISM potensial til å overvåke vekst vitalitet og produkt dannelse på et enkelt cellenivå under alle stadier av en bioprosessen for identifisering av optimale dyrking forhold, eller for det formål å behandle kontroll. Metodene som er beskrevet her er fokusert på mikrobielle applikasjoner med enkeltceller, men er også gjeldende for større partikler som menneske-og dyreceller, celle agglomerater og pellets av trådformede organismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

In situ overvåking i mikrobiell bioprocesses er hovedsakelig begrenset til kjemiske og fysiske egenskaper av mediet (f. ekspH-verdi og oppløst oksygen konsentrasjon). Likevel kan morfologi av celler være en passende indikator for optimale forhold, siden det endres med avhengighet av vekst staten, produkt akkumulering og celle stress. Videre gir enkelt Cellestørrelse fordelingen ikke bare informasjon om dyrking forhold, men også om befolkningen heterogenitet. For å få slik informasjon, ble en foto-optisk in situ mikroskopi enhet1 utviklet for å muliggjøre overvåking av enkelt Cellestørrelse fordeling direkte i celle suspensjonen i bioreaktorer. En automatisert bildeanalyse er koplet til mikroskopi basert på et nettverk modell, som er trent med bruker-kommenterte bilder. Flere parametre, som er oppnådd fra fanger av mikroskopet, er korrelert å behandle relevante funksjoner i cellene, som deres metabolske aktivitet. Inntil nå, den presenterte in situ mikroskopi sonde serien ble brukt for å måle pellet størrelse i trådformede sopp suspensjoner. Den ble brukt til å skille enkelt Cellestørrelse i mikroalger dyrking og forholde det til lipid akkumulering. Formen på cellulære partikler var relatert til spirende i gjær kulturer. Den mikroskopi analysen kan vanligvis deles inn i tre trinn: (i) bildeoppkjøp, (II) partikkel identifisering, og (III) dataanalyse, henholdsvis. Alle tiltak må tilpasses organismen, og derfor er spesifikk kommentert informasjon kreves for å oppnå pålitelige resultater. Muligheten til å overvåke endringer i celle morfologi direkte i linje eller på linje (i et by-pass) muliggjør sann tidsverdier for overvåking og kontroll, i Prosessutvikling og i produksjonsskala. Hvis av linje dataene samsvarer med sanntidsdataene, blir gjeldende kjedelige av- linje målinger med ukjente påvirkninger på cellestørrelsen unødvendig.

Den Cellestørrelse deteksjon i gjær kulturer med ISM og automatisert bildegjenkjenning for å skille mellom spirende og ikke-spirende celler ble vellykket gjennomført. Både stroboscope intensitet og valg av måle gapet har en rekke toleranse, der partikkel identifikasjonen ikke påvirkes. For eksempel ble S. cerevisiae celler målt med ulike stroboscope intensitet innenfor et variasjonsområde på 11% ved en tørr biomasse konsentrasjon av 4 g L-1. De tilsvarende b...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

En foto-optisk in situ mikroskopi enheten ble utviklet for å overvåke størrelsen på enkeltceller direkte i cellen suspensjonen. Sann tids målingen utføres ved å kobling Foto-optiske vanndampsteriliseres sonde til en automatisert bildeanalyse. Morfologiske endringer vises med avhengighet av vekst tilstand og dyrking forhold.

In situ Mikroskopi for Real-Time bestemmelse av single-celle morfologi i Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om populasjons heterogenitet gjennom den morfologiske vurderingen av cellene. In situ mikroskopi tillater studie dyrking forhold, prosessavlinger, og produktkvalitet. Den største fordelen med denne teknikken er en in situ måling, som gir sanntidsdata uten prøvetaking eller bringe risiko for forurensning.In situ mikroskopi skrevet til automatisert bildegjenkjenning kan gi ytterligere informasjon om cellulære strukturer, form, og celle agglomerering utover størrelse. Det er også mulig å måle cellekonsentrasjoner. Metoden har vist seg å være et pålitelig verktøy.Ingen alternativ metode gir samme informasjon på så kort tid og lav innsats for prøveklargjøring. Metoden er tilpasset ulike bioprosesser og mikroorganismer, SEG filamentøse sopp, mikroallergi og gjær. Sonden brukes sammen med en datamaskin.Maskinvaren består av en enkelt stangsonde med et høyoppløselig CCD-kamera. Celler som passerer gjennom et justerbart målegap, blir avbildet av kameraet. Lyset kommer inn i gapet på motsatt side av kameraet, noe som betyr at belysning er ved overføring.Angi maskinvareparameterne ved hjelp av cellekonsentrasjoner som strekker seg over det forventede området. Begynn å gjøre forberedelser for offline målinger. Bruk en tykkelsesmåler til å justere målegapet.Drei deretter probeskruemutteren for å sette målegapet til fem eller 10 ganger maksimal forventet cellediameter. Åpne probekontrollerprogramvaren på datamaskinen. Velg ønsket sonde i programvaren og gå til seksjonshandlinger.Trykk deretter på Koble til. Deretter går du til Probe Control-fanen og åpner den. Start videostrømming ved å trykke på avspillingsknappen.Fest sonden til et stativ og utfør følgende trinn for hver måling. Arbeid med sonden og spray etanol i målegapet. Tørk forsiktig av støv eller smuss med optisk papir.På datamaskinen bruker du live view for å kontrollere at glasset på sensoren er fri for partikler. Deretter plasserer du et tørt optisk papir i målegapet for fokusering. Vri bindingsskruen for å flytte fokus manuelt.Slutt å fokusere når enkeltfibrene på papiret i målegapet er tydelig sett. Få et rør fylt med kulturbuljong. Dypp mikroskopet i buljongen, slik at gapet er fullt dekket med cellefjæring.Bruk bindingsskruene til å finjustere fokuset på cellene. Når dette fokuset er gjort, ikke endre det igjen under eksperimentet. Gå tilbake til programvaren for eksperimentet.Gå til Utløser-menyen. Angi bildefrekvensen under Utløser-menyen. En hertz anbefales for offline målinger.Derfra går du til feltet Rammer per utløser og angir det etter behov for god statistikk. Her, ca 200. Gå også til Generelt-menyen.Der velger du katalogen der bildene skal lagres. Start bildeanskaffelse med knappen Start bildeutløserinnhenting. Flytt forsiktig røret for å indusere strømningen i målegapet.Bruk bildene fra første kjøring av eksperimentet som et treningssett. Ha åpen kildekode programvare Fiji klar og slippe bildene fra eksperimentet inn i vinduet. Når du er ferdig, velger du Analyser, etterfulgt av Verktøy og deretter ROI Manager.Deretter velger du et markeringsverktøy. I bildet bestemmer du deg for en partikkel for å kommentere som er i fokus. Tegn en sirkel rundt den med markeringsverktøyet.Trykk Legg til for å legge til merknaden i ROI Manager. Deretter velger du et penselverktøy og velger en passende pikselstørrelse. Bruk penselverktøyet til å finjustere utvalget.Fortsett å merke alle objekter av interesse på samme måte på ca 15 bilder. Lagre de kommenterte filene, og bruk dem som et opplæringssett. Når gjenkjenningsalgoritmen er opplært og klar, kan du bruke den til å visualisere resultater.Gå til Fil i Resultatanalyse, etterfulgt av Importer fil. Der velger du ønsket resultatfil. Fortsett med å trykke på Opprett diagram-knappen.Velg Distribusjonsdiagram. Dette vil vise den morfologiske fordelingen av kulturen. Gå tilbake til Opprett diagram for å velge Følsomhetsplott.Informasjonen som vises, kan bidra til å avgjøre hvor mange celler som må analyseres for å oppnå ønsket nøyaktighet. Utfør elektroniske målinger etter å ha fullført frakoblede målinger. For online målinger, koble sonden direkte til en bioreaktor.Når den er tilkoblet, steriliser monteringen riktig. Velg Overvåking på instrumentbordet. Det er en avspillingsknapp for å starte bildeanskaffelse og en stoppknapp for å avslutte den.Trykk på avspillingsknappen. På bioreaktoren begynner inokulasjon av kulturen. Kameraet vil fange video av cellene og automatisk identifisere dem for analyse.Overvåkingen gir online data av cellestørrelser og former av forskjellige cellemorfologier under hele gjæringen. Sanntidsresultatene kan formateres på ulike måter og eksporteres også for videre analyse. Denne tomten av kumulative fordelinger av S.Cerevisiae cellediameter er opprettet fra data analysert ved hjelp av denne teknikken.Det demonstrerer automatisk cellegjenkjenning er i stand til å skille spirende og ikke-spirende celler. Den faste kurven er fordelingen under en dyrking på tre timer. Den stiplede kurven er fordelingen av samme dyrking på syv timer.Den stiplede kurven representerer data samlet inn etter 13 timer. Merknadsprosedyren er tidkrevende, men det er nøkkelen for å oppnå ønsket nøyaktighet for celleidentifikasjonen. Med denne fremgangsmåten, hvis måletidene er kortere enn prosessdynamikken, kan sanntidsmålingen brukes til prosesskontroll.Denne teknikken baner vei for å bruke måling av populasjons heterogenitet som prosessparameter for mikrobielle dyrkinger fra de tidlige prosessutviklingstrinnene til produksjonsskala.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifisering av Global diastolisk funksjon av Kinetisk modellering basert analyse av transmitral Flow via Parametrized diastolisk Fylling formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Håndholdt Tredimensjonal Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Menneskelig angiografi og Funksjonell prekliniske studier i Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic Force Mikros Basert Biopanning for isolering av morfologi spesifikke reagenser mot TDP-43 Varianter i Amyotrofisk lateral sklerose

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Måling TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Bruker en FRET basert Mikros analysen

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokoll for sanntids 3D enkelt partikkel sporing

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En av beryllium gjennomstrømming Microfluidic plattform for enkeltceller genomet sekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...