Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Os autores são gratos pelo apoio do Ministério Federal alemão de Economia e Energia no âmbito ZIM-Koop, projeto "Smart Process Inspection", concede não. ZF 4184201CR5.

NOTA: Os seguintes passos são necessários para adaptar os parâmetros às respectivas condições de microrganismos e cultura. O ajuste das configurações da sonda dura cerca de 20 min para um usuário experiente. Uma descrição detalhada das ferramentas e etapas é dada no manual correspondente da ponta de prova de SOPAT GmbH. Em geral, são necessárias as ferramentas que são apresentadas no seguinte protocolo: (i) Controlador de sonda para ajustes de sonda e aquisição de imagem; (ii) Fiji (ImageJ)<...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

O ISM apresentado aqui com os mesmos ou dispositivos muito semelhantes foi usado para medir a dinâmica morfológica de fungos, microalgas e células de levedura, o que possibilitou a determinação da atividade de crescimento e, em caso de algas, acúmulo de produtos intracelulares. O sensor não tem peças móveis e é diretamente aplicável em qualquer biorreator de tanque mexido padrão, seja através de uma porta padrão ou em um desvio estéril. Desde que o fermento é muito menor do que algas, a redução no taman...

Características morfológicas das células são muitas vezes relacionadas ao estado fisiológico, uma conexão entre forma e função existe para muitas aplicações. A morfologia de uma única célula é influenciada pelo estado de crescimento, idade da célula, estresses ómóticos e outras células potenciais ou acúmulo de produtos. As mudanças morfológicas das células são muitas vezes uma medida da vitalidade do crescimento de uma cultura. Síntese de produtos intracelulares, acúmulo de lipídios em algas e formação corporal de inclusão em bactérias, entre outras, estão relacionados com o tamanho celular também. Aglomeração celular pode ser outro fator que vale a pena investigar como resumido recentemente2.
As heterogeneidades populacionais podem ser quantificadas com base em características morfológicas das células individuais. Estudos mostraram que a heterogeneidade dentro de uma cultura pode ser significativa, por exemplo,condições de produção em larga escala3 o rendimento global pode ser afetado por um baixo desempenho de subpopulações4.
Normalmente, a avaliação das características morfológicas das células é realizada por amostragem manual ou com uma câmara de fluxo de passagem acoplada a um dispositivo foto-óptico. Isso leva a várias restrições: a quantidade limitada de dados adquiridos dificilmente pode fornecer medições estatisticamente confiáveis; o atraso de tempo entre a amostragem e a acessibilidade dos resultados pode ser muito longo em comparação com a dinâmica do processo; e mais importante, o procedimento de amostragem (localização da porta de amostragem, pré-tratamento da amostra antes da medição, condições desfavoráveis no tubo de amostragem ou bypass) pode desencadear um erro tendencioso, pois o procedimento de amostra em si já pode afetar a célula Morfologia. Finalmente, existe sempre um alto risco de contaminação durante a amostragem ou em soluções de passagem suplementar, se eles não são esterilizáveis no lugar.
A aplicação da microscopia in situ (ISM) pode contornar vários desses problemas. Se as células forem detectadas automaticamente, uma identificação correta de suas características morfológicas pode ser pesquisada5. Até agora, as principais limitações deste método eram (i) o tempo de avaliação das imagens, que era muito longa para aplicações in situ, e (ii) a má resolução de imagens, especialmente em altas densidades celulares. Embora as primeiras soluções do ISM incluíssem amostragem mecânica, diluição da sonda, ou foram restritas a um sistema de passagem suplementar6,7,outras abordagens permitem a captura da suspensão celular diretamente8.
Os recentes avanços no ISM permitem o monitoramento em linha ou on-line das células em uma base unicelular, o que fornece a distribuição de parâmetros morfológicos em tempo real diretamente em suspensões celulares em concentrações de células consideravelmente altas. Através de análises off-line dos parâmetros-chave das células, correlações com informações fornecidas pela detecção automatizada de células acoplada e ISM podem ser identificadas. Em seguida, novos projetos de sensores macios são alcançados, nos quais um parâmetro incomensurável é estimado com a morfologia unicelular.
Neste relatório, o ISM é conduzido acoplásse uma sonda foto-óptica a uma análise de imagem automatizada. O ISM consiste em uma sonda de sensor de haste única que permite a captura de imagens dentro de uma faixa de foco conhecida em uma lacuna de medição ajustável com uma câmera CCD de alta resolução [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) e MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)]. A iluminação da luz flash é conduzida pela transmissão. Portanto, a luz se origina do lado oposto da câmera9 e sua intensidade pode ser ajustada. As células passam continuamente por essa lacuna com o fluxo líquido. Assim, uma população representativa da amostra é obtida. A sonda pode ser montada diretamente para o biorreator para que ele atinja a suspensão celular, ou pode ser usado em um desvio estéril. A casca do sensor é conectada ao sistema antes da esterilização, as peças ópticas são montadas mais tarde no escudo.
Até agora, os microorganismos industriais relevantes, por exemplo,fungos filamentosos (diâmetro de até mais de 200 μm), as microalgas heterotróficas Crypthecodinium cohnii (diâmetro médio celular de 20 μm), e o fermento Saccharomyces cerevisiae (diâmetro médio celular de 5 μm), foram investigados com este ou dispositivos similares, o que é mal descrito.
Fungos filamentosos tendem a formar pelotas certas condições de cultivo. Estes são de um tamanho de até várias centenas de μm. A híha das células fúngicas desenvolve diferentes comprimentos na dependência do estresse hidrodinâmico na fase de fluido. Isso tem uma influência sobre a atividade metabólica e de crescimento, captação de substratos e liberação de produtos. O ISM foi aplicado para identificar a distribuição do tamanho da pelota e a largura das zonas de menor densidade de biomassa nas bordas das pelotas (dados não publicados próprios).
O tamanho de C. cohnii altera entre 15 e 26 μm quando as células acumulam o ácido graxo poliinsaturado ácido graxo ácido docosahexaenóico (DHA) limitação de nitrogênio. Este processo de produção de DHA biotecnológico consiste em duas partes, a fase de crescimento, em que as células se dividem e se tornam menores, e a fase de produção, na qual as células acumulam o produto e, assim, tornam-se maiores. Portanto, o tamanho da célula foi usado para determinar o estado do processo, no qual o crescimento ou a produção de DHA foram favoráveis. Finalmente, uma correlação entre o tamanho da célula e o conteúdo dha foi encontrada. Neste caso, o ISM permite monitorar o acúmulo intracelular de DHA em tempo real sem a exigência de amostragem, interrupção celular e a análise de cromatografia a gás comum10.
O fermento de brotamento é geralmente de um tamanho entre 3 e 8 μm. A proporção de células que estão no estado de maturação de cada vez, conforme descrito com o índice de brotamento (BI), fornece informações sobre a vitalidade de crescimento11,12, e até mesmo uma relação com a secreção de proteína recombinante foi comprovada13. Com a ajuda do ISM, as células de levedura em ascensão e não brotamento (células com e sem um broto) foram distinguidas14. As condições de estresse também podem levar a uma variação mais ampla do tamanho da célula dentro de uma população de levedura, como recentemente mostrado em cultivos em escala para baixo, em que as condições de cultivos em lote alimentado em grande escala limitados por nutrientes foram imitadas3.
Portanto, o ISM tem o potencial de monitorar a vitalidade do crescimento e a formação de produtos em um nível unicelular durante todas as etapas de um bioprocesso para a identificação de condições ideais de cultivo, ou para fins de controle de processos. Os métodos descritos aqui estão focados em aplicações microbianas com células únicas, mas também são aplicáveis a partículas maiores, como células humanas e animais, aglomeradas celulares e pelotas de organismos filamentosos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

O monitoramento in situ em bioprocessos microbianos é restrito principalmente a propriedades químicas e físicas do meio(por exemplo,valor do pH e concentração de oxigênio dissolvido). No entanto, a morfologia das células pode ser um indicador adequado para condições ideais, uma vez que muda com a dependência do estado de crescimento, acumulação de produtos e estresse celular. Além disso, a distribuição de tamanho unicelular fornece não apenas informações sobre as condições de cultivo, mas também sobre a heterogeneidade populacional. Para obter tais informações, foi desenvolvido um dispositivo de microscopia in situ foto-óptica1 para permitir o monitoramento da distribuição de tamanho unicelular diretamente na suspensão celular em biorreatores. Uma análise de imagem automatizada é acoplada à microscopia baseada em um modelo neural da rede, que seja treinado com imagens usuário-anotadas. Vários parâmetros, que são obtidos a partir das capturas do microscópio, estão correlacionados ao processo de características relevantes das células, como sua atividade metabólica. Até agora, a série apresentada da ponta de prova da microscopia do in situ foi aplicada para medir o tamanho da pelota em suspensões filamentous dos fungos. Foi usado para distinguir o tamanho unicelular no cultivo de microalgas e relacioná-lo ao acúmulo de lipídios. A forma de partículas celulares foi relacionada ao brotamento em culturas do fermento. A análise da microscopia pode ser geralmente dividida em três etapas: (i) aquisição de imagem, (ii) identificação de partículas e (iii) análise de dados, respectivamente. Todas as etapas devem ser adaptadas ao organismo e, portanto, são necessárias informações anotadas específicas para alcançar resultados confiáveis. A capacidade de monitorar as mudanças na morfologia celular diretamente em linha ou on-line (em um desvio) permite valores em tempo real para monitoramento e controle, no desenvolvimento de processos, bem como na escala de produção. Se os dados off-line se correlacionarem com os dados em tempo real, as medições off-line tediosas atuais com influências desconhecidas no tamanho da célula se tornam desnecessárias.

A detecção do tamanho da pilha em culturas do fermento com o ISM e a deteção automatizada da imagem para distinguir entre pilhas de brotamento e non-budding foi conduzida com sucesso. Tanto a intensidade do stroboscope quanto a escolha da lacuna de medição têm uma gama de tolerância, na qual a identificação de partículas não é afetada. Por exemplo, as células de S. cerevisiae foram medidas com várias intensidades de estóscópio dentro de uma faixa de variação de...

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In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Um dispositivo de microscopia in situ foto-óptico foi desenvolvido para monitorar o tamanho de células individuais diretamente na suspensão celular. A medição em tempo real é conduzida aparando a sonda esterilizável foto-óptica a uma análise de imagem automatizada. Mudanças morfológicas aparecem com dependência do estado de crescimento e das condições de cultivo.

Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Esse método pode ajudar a responder a questões-chave da heterogeneidade populacional através da avaliação morfológica das células. A microscopia in situ permite estudar condições de cultivo, rendimentos de processos e qualidade do produto. A principal vantagem dessa técnica é uma medição in situ, que fornece dados em tempo real sem amostragem ou trazendo risco de contaminação.A microscopia in situ acoplada ao reconhecimento automatizado de imagens pode fornecer informações adicionais sobre estruturas celulares, forma e aglomeração celular além do tamanho. Também é possível medir concentrações celulares. O método provou ser uma ferramenta confiável.Nenhum método alternativo fornece as mesmas informações em tão pouco tempo e baixo esforço para a preparação da amostra. O método foi adaptado a vários bioprocessos e microrganismos, fungos filamentosos seg, micro-alergia e levedura. A sonda é usada em conjunto com um computador.O hardware consiste em uma única sonda de haste com uma câmera CCD de alta resolução. As células que passam por uma lacuna de medição ajustável são imagens pela câmera. A luz entra na abertura em frente à câmera, o que significa que a iluminação é por transmissão.Defina os parâmetros de hardware usando concentrações de células que abrangem o alcance esperado. Comece a fazer preparações para medições offline. Use um medidor de espessura para ajustar a lacuna de medição.Em seguida, gire a porca do parafuso da sonda para definir a lacuna de medição para cinco ou dez vezes o diâmetro máximo esperado da célula. No computador, abra o software do controlador de sonda. No software, selecione a sonda desejada e vá para as ações de seção.Em seguida, pressione Connect. Em seguida, vá para a guia Controle da sonda e abra-a. Inicie a transmissão de vídeo pressionando o botão de reprodução.Corrija a sonda em um tripé e execute as seguintes etapas para cada medição. Trabalhe com a sonda e pulverize o etanol na abertura de medição. Limpe cuidadosamente qualquer poeira ou sujeira com papel óptico.No computador, use a visão ao vivo para verificar se o vidro do sensor está livre de partículas. Em seguida, coloque um papel óptico seco na abertura de medição para o foco. Gire o parafuso de ligação para mover o foco manualmente.Pare de se concentrar quando as fibras únicas do papel na lacuna de medição forem claramente vistas. Agora, pegue um tubo cheio de caldo de cultura. Mergulhe o microscópio no caldo, para que a lacuna esteja totalmente coberta com suspensão celular.Use os parafusos de ligação para ajustar o foco nas células. Uma vez que este foco é feito, não alterá-lo novamente durante o experimento. Retorne ao software para o experimento.Vá para o menu Triggering. No menu Acionamento, defina a taxa de quadros. Um hertz é recomendado para medições offline.A partir daí, vá para o campo Frames Per Trigger e defina-o conforme necessário para boas estatísticas. Aqui, cerca de 200. Além disso, vá para o menu Geral.Lá, selecione o diretório em que as imagens serão salvas. Inicie a aquisição de imagens com o botão Iniciar Imagem Trigger Acquisition Acquisition. Mova suavemente o tubo para induzir o fluxo na abertura de medição.Use as imagens da primeira execução do experimento como um conjunto de treinamento. Tenha o software de código aberto Fiji pronto e solte as imagens do experimento em sua janela. Quando terminar, selecione Analisar, seguido por Ferramentas, depois ROI Manager.Em seguida, escolha uma ferramenta de seleção. Na imagem, decida sobre uma partícula para anotar que está em foco. Desenhe um círculo em torno dele com a ferramenta de seleção.Pressione Adicionar para adicionar a anotação ao gerenciador de ROI. Em seguida, selecione uma ferramenta de escova e escolha um tamanho de pixel apropriado. Use a ferramenta de escova para refinar a seleção.Continue marcando todos os objetos de interesse da mesma forma em cerca de 15 imagens. Salve os arquivos anotados e use-os como um conjunto de treinamento. Quando o algoritmo de reconhecimento estiver treinado e pronto, use-o para visualizar resultados.No Analisador de Resultados, vá para Arquivo, seguido de Arquivo de Importação. Lá, selecione o arquivo de resultados desejado. Continue pressionando o botão Criar gráfico.Selecione o gráfico de distribuição. Isso mostrará a distribuição morfológica da cultura. Retorne ao Gráfico de Criação para selecionar o Plot de Sensibilidade.As informações exibidas podem ajudar a determinar quantas células devem ser analisadas para obter a precisão desejada. Realize medições on-line após concluir medições offline. Para medições on-line, conecte a sonda diretamente a um bioreator.Uma vez conectado, esterilize corretamente o conjunto. Selecione Monitoramento no painel. Há um botão de reprodução para iniciar a aquisição de imagens e um botão stop para termetá-lo.Pressione o botão de reprodução. No bioreator, inicie a inoculação da cultura. A câmera capturará o vídeo das células e as identificará automaticamente para análise.O monitoramento fornece dados on-line de tamanhos celulares e formas de diferentes morfologias celulares durante toda a fermentação. Os resultados em tempo real podem ser formatados de várias formas e também exportados para análise suplementar. Este enredo de distribuições cumulativas do diâmetro da célula S.Cerevisiae é criado a partir de dados analisados utilizando essa técnica.Ele demonstra que o reconhecimento automático de células é capaz de distinguir células brotantes e não brotantes. A curva sólida é a distribuição durante um cultivo de três horas. A curva pontilhada é a distribuição do mesmo cultivo em sete horas.A curva tracejada representa dados coletados às 13 horas. O procedimento de anotação é demorado, mas é a chave para alcançar a precisão desejada para a identificação celular. Com este procedimento, se os tempos de medição forem menores do que a dinâmica do processo, a medição em tempo real poderá ser usada para o controle de processos.Essa técnica abre caminho para o uso da medição da heterogeneidade populacional como parâmetro de processo para cultivos microbianos desde as primeiras etapas de desenvolvimento de processos até a escala de produção.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...