Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Авторы благодарны за поддержку Федерального министерства экономики и энергетики Германии в рамках проекта «Умный процесс инспекции», гранта нет. NoФ 4184201CR5.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги необходимы для адаптации параметров к соответствующим условиям микроорганизмов и культуры. Настройка настроек зонда длится около 20 минут для опытного пользователя. Подробное описание инструментов и шагов приведено в соответствующем руководстве по зондиро...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM, представленный здесь с теми же или очень похожими устройствами, использовался для измерения морфологической динамики грибов, микроводорослей и дрожжевых клеток, что позволило определить активность роста, а в случае водорослей, внутриклеточного накопления продукта. Датчик не имеет...

Морфологические особенности клеток часто связаны с физиологическим состоянием, связь между формой и функцией существует для многих применений. На морфологию одной клетки влияет состояние роста, возраст клетки, осмотические и другие потенциальные клеточные стрессы или накопление продукта. Морфологические изменения клеток часто являются мерилом жизнеспособности роста культуры. Синтез внутриклеточного продукта, накопление липидов в водорослях и включение тела в бактериях, среди прочего, связаны с размером клеток, а также. Клеточная агломерация может быть еще одним фактором, который стоит исследовать, как обобщено недавно2.
Неоднородность популяции может быть количественно определена на основе морфологических особенностей отдельных клеток. Исследования показали, что неоднородность в рамках культуры может быть значительным, например,в крупномасштабных производственных условиях3 общая урожайность может быть затронута низкой производительностью субпопуляций4.
Как правило, оценка морфологических особенностей клеток проводится путем ручного отбора проб или с помощью камеры потока в сочетании с фотооптическим устройством. Это приводит к нескольким ограничениям: ограниченное количество полученных данных вряд ли может обеспечить статистически достоверные измерения; задержка между выборкой и доступностью результатов может быть слишком длительной по сравнению с динамикой процесса; и самое главное, процедура отбора проб (расположение порта выборки, предварительная обработка образца до измерения, неблагоприятные условия в выборке или шунтирование) может вызвать предвзятую ошибку, поскольку сама процедура выборки уже может повлиять на клетку Морфология. Наконец, всегда существует высокий риск загрязнения во время отбора проб или в обходных растворах, если они не стерилизованы на месте.
Применение микроскопии на месте (ISM) может обойти некоторые из этих проблем. Если клетки обнаружены автоматически, то можно обследовать правильное определение их морфологических особенностей5. До сих пор основными ограничениями этого метода были (i) время оценки изображений, которое было слишком длинным для приложений situ, и ii) плохое разрешение изображений, особенно при высокой плотности клеток. Хотя первые решения ISM включали механическую пробы, разбавление зонда, или были ограничены системой обхода6,7, дальнейшие подходы позволяют захват ячейки подвески непосредственно 8 .
Последние достижения в ISM позволяют в линии или на линии мониторинга клеток на одноклеточной основе, которая обеспечивает распределение морфологических параметров в режиме реального времени непосредственно в клеточных суспензий при значительно высоких концентрациях клеток. Через офлайн-анализ ключевых параметров клеток можно определить корреляции с информацией, предоставляемой совмещенный автоматизированным обнаружением клеток и ISM. Затем достигаются новые конструкции мягких датчиков, в которых неизмеримый параметр оценивается с помощью одноклеточной морфологии.
В этом отчете ISM проводится путем соединения фотооптического зонда с автоматизированным анализом изображений. ISM состоит из однородчатого датчика зонда, который позволяет захват изображения в пределах известного диапазона фокусов в регулируемом зазоре измерения с камерой CCD высокого разрешения «MM-Ho » CCD GT2750 (2750x2200) и MM 2.1 CMOS G507c (2464x2056)». Освещение вспышки света осуществляется путем передачи. Таким образом, свет исходит от противоположной стороны камеры9 и его интенсивность может быть скорректирована. Клетки проходят непрерывно через этот зазор с жидким потоком. Таким образом, получается репрезентативная выборка населения. Зонд может быть установлен непосредственно на биореактор, так что он достигает в ячейки подвески, или он может быть использован в стерилижаемый обходной. Оболочка датчика подключена к системе до стерилизации, оптические части затем устанавливаются в оболочку.
До сих пор, соответствующие промышленные микроорганизмы, например,нитевидные грибы (диаметр до более 200 мкм), гетеротрофные микроводоросли Crypthecodinium cohnii (средний диаметр ячейки 20 мкм), и дрожжи Saccharomyces cerevisiae (средний диаметр ячейки 5 мкм), были исследованы с помощью этого или аналогичных устройств, которые описаны в ближайшее время.
Filamentous грибы, как правило, образуют гранулы при определенных условиях выращивания. Они имеют размер до нескольких сотен мкм. Гифы грибковых клеток развивают различную длину в зависимости от гидродинамического стресса в фазе жидкости. Это влияет на метаболическую и ростовую активность, поглощение субстрата и высвобождение продукта. ISM применялся для определения распределения размеров гранул и ширины зон с более низкой плотностью биомассы по краям гранул (собственные неопубликованные данные).
Размер C. cohnii изменяется между 15 и 26 мкм, когда клетки накапливают полиненасыщенную жирную кислоту докозагексаеновой кислоты (ДГК) под ограничением азота. Этот биотехнологический процесс производства ДГК состоит из двух частей: фазы роста, в которой клетки делятся и становятся меньше, и фазы производства, в которой клетки накапливают продукт и таким образом становятся больше. Таким образом, размер ячейки был использован для определения состояния процесса, в котором либо рост или производство ДГК было благоприятным. Наконец, была обнаружена корреляция между размером ячейки и содержанием ДГК. В этом случае ISM позволяет контролировать внутриклеточное накопление ДГК в режиме реального времени без необходимости отбора проб, нарушения клеток и общего анализа газовой хроматографии10.
Начинающие дрожжи, как правило, размерот 3 до 8 мкм. Доля клеток, которые находятся в состоянии созревания в то время, как описано с начинающим индексом (BI), предоставляет информацию о жизнеспособности роста11,12, и даже связь с рекомбинантной секреции белка было доказано13. С помощью ISM, подающий надежды и не-бутонизации дрожжевых клеток (клетки с и без бутона) были отмечены14. Стресс овечие условия могут также привести к более широкому изменению размера клеток в популяции дрожжей, как недавно показано в масштабе вниз культивирования, в котором условия крупномасштабных питательных ограниченных кормления-пакет культивирования были передразнил3.
Таким образом, ISM имеет потенциал для мониторинга жизнеспособности роста и формирования продукта на одноклеточном уровне на всех этапах биопроцесса для определения оптимальных условий культивирования, или для целей контроля процесса. Методы, описанные здесь, сосредоточены на микробных применениях с одиночными клетками, но также применимы к более крупным частицам, таким как клетки человека и животных, клеточные агломераты и гранулы нитевидных организмов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

При наблюдении в микробных биопроцессах в основном ограничиваются химическими и физическими свойствами среды(например,значение рН и концентрация растворенного кислорода). Тем не менее, морфология клеток может быть подходящим индикатором для оптимальных условий, так как она меняется с зависимостью от состояния роста, накопления продукта и клеточного стресса. Кроме того, распределение одноклеточных размеров дает не только информацию об условиях культивирования, но и о неоднородности популяции. Для получения такой информации было разработано фото-оптическое устройство микроскопии1 для мониторинга распределения размеров одноклеточных элементов непосредственно в клеточной подвеске в биореакторах. Автоматизированный анализ изображений связан с микроскопией на основе модели нейронной сети, которая обучается с аннотированными пользователями изображениями. Несколько параметров, которые приобретаются из захватов микроскопа, коррелируют с соответствующими особенностями процесса клеток, такими как их метаболическая активность. До сих пор, представленные на месте микроскопии зонд серии был применен для измерения размера гранул в нитевидных грибов суспензии. Он был использован, чтобы различать одноклеточные размеры в микроводорослей культивирования и связать его с липидным накоплением. Форма клеточных частиц была связана с бутонизации в дрожжевых культурах. Анализ микроскопии, как правило, можно разделить на три этапа: i) приобретение изображения, (ii) идентификация частиц и (iii) анализ данных, соответственно. Все шаги должны быть адаптированы к организму, и поэтому для достижения надежных результатов необходима конкретная аннотированная информация. Способность контролировать изменения в морфологии клеток непосредственно в строке или в режиме (в обходном проходе) обеспечивает в режиме реального времени значения для мониторинга и контроля, в разработке процесса, а также в производственном масштабе. Если данные в автономном режиме коррелируют с данными в реальном времени, то текущие утомительные измерения вне очереди с неизвестными влияниями на размер ячейки становятся ненужными.

Обнаружение размера клеток в дрожжевых культурах с ISM и автоматизированным обнаружением изображений для разграничения между бутонизации и не-бутонизации клеток была успешно проведена. И интенсивность stroboscope и выбор зазоризмерения имеют ряд допускаемости, в котором ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Для мониторинга размеров одиночных клеток непосредственно в клеточной подвеске было разработано фото-оптическое устройство для микроскопии. Измерение в реальном времени проводится путем соединения фотооптического стерилизационного зонда с автоматизированным анализом изображений. Морфологические изменения появляются с зависимостью от состояния роста и условий культивирования.

На Ситу Микроскопия для определения одноклеточной морфологии в биопроцессах в режиме реального времени

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы неоднородности популяции с помощью морфологической оценки клеток. Микроскопия in situ позволяет изучать условия выращивания, урожайность процессов и качество продукции. Основным преимуществом этого метода является измерение на месте, которое предоставляет данные в режиме реального времени без отбора проб или риска загрязнения.Микроскопия in situ соединенная к автоматизированному опознаванию изображения может обеспечить дополнительную информацию о клетчатых структурах, форме, и агломерации клетки за размером. Также можно измерить концентрацию клеток. Метод зарекомендовал себя как надежный инструмент.Ни один альтернативный метод не предоставляет такую же информацию за столь короткое время и низкие усилия по подготовке образца. Метод был адаптирован к различным биопроцессорам и микроорганизмам, нитематозным грибам SEG, микроа аллергии и дрожжам. Зонд используется в сочетании с компьютером.Оборудование состоит из одного стержня зонда с высоким разрешением CCD камеры. Ячейки, которые проходят через регулируемый зазор измерения, изображены камерой. Свет входит в зазор напротив камеры, то есть освещение по передаче.Установите аппаратные параметры с использованием концентраций клеток, которые охватывают ожидаемый диапазон. Начните готовиться к офлайн-измерениям. Используйте датчик толщины для регулировки зазора измерения.Затем поверните гайку винта зонда, чтобы установить зазор измерения в пять или 10 раз максимальный ожидаемый диаметр клетки. За компьютером откройте программное обеспечение контроллера зонда. В программном обеспечении выберите нужный зонд и перейдите к действиям раздела.Затем нажмите Connect. Далее перейдите на вкладку Управления зондом и откройте ее. Начните потоковое видео, нажав кнопку воспроизведения.Зафиксировать зонд на штатив и выполнить следующие шаги для каждого измерения. Работа с зондом и спрей этанола в измерении разрыва. Тщательно протрите любую пыль или грязь с помощью оптической бумаги.За компьютером используйте живой вид, чтобы проверить, что стекло датчика не имеет частиц. Затем поместите сухую оптическую бумагу в зазор измерения для фокусировки. Поверните вязающий винт, чтобы переместить фокус вручную.Прекратите фокусировку, когда четко видны одиночные волокна бумаги в зазоре измерения. Теперь возьми трубку, наполненную культурным бульоном. Опустите микроскоп в бульон, поэтому зазор полностью покрыт клеточной подвеской.Используйте связывающие винты для точной настройки фокуса на ячейках. Как только эта фокусировка будет выполнена, не меняй ее снова во время эксперимента. Вернитесь к программному обеспечению для эксперимента.Перейти к триггерного меню. В меню Триггеринга установите частоту кадров. Один герц рекомендуется для автономных измерений.Оттуда перейдите на поле Frames Per Trigger и установите его по мере необходимости для хорошей статистики. Здесь около 200. Кроме того, перейдите в общее меню.Там выберите каталог, в котором изображения будут сохранены. Начните приобретение изображений с помощью кнопки Start Image Trigger Acquisition. Аккуратно переместите трубку, чтобы вызвать поток в зазоре измерения.Используйте изображения с первого запуска эксперимента в качестве учебного набора. Иметь программное обеспечение с открытым исходным кодом Фиджи готовы и падение изображения из эксперимента в свое окно. Когда это будет сделано, выберите Анализ, а затем инструменты, затем ROI Manager.Далее выберите инструмент выбора. На изображении, принять решение о частице аннотировать, что находится в фокусе. Нарисуйте круг вокруг него с помощью инструмента выбора.Нажмите Добавить, чтобы добавить аннотацию к roi Manager. Далее выберите инструмент кисти и выберите соответствующий размер пикселя. Используйте инструмент кисти для уточнения выбора.Продолжить маркировку всех объектов, представляющих интерес таким же образом, около 15 изображений. Сохраните аннотированные файлы и используйте их в качестве учебного набора. Когда алгоритм распознавания обучен и готов, используйте его для визуализации результатов.В анализаторе результатов перейдите в файл, за которым следует файл импорта. Там выберите нужный файл результатов. Продолжить, нажав кнопку Создать диаграмму.Выберите диаграмму распределения. Это будет отображать морфологическое распределение культуры. Вернитесь к созданию диаграммы, чтобы выбрать участок чувствительности.Отображаемая информация может помочь определить, сколько ячеек должно быть проанализировано, чтобы получить желаемую точность. Выполните онлайн-измерения после завершения автономных измерений. Для онлайн-измерений подключите зонд непосредственно к биореактору.После подключения, правильно стерилизовать сборку. Выберите Мониторинг в панели мониторинга. Существует кнопка воспроизведения, чтобы начать получение изображения и кнопка остановки, чтобы закончить его.Нажмите кнопку воспроизведения. В биореакторе начните прививку от культуры. Камера будет захватывать видео клеток и автоматически идентифицировать их для анализа.Мониторинг предоставляет онлайн данные о размерах клеток и формах различных морфологий клеток в течение всего брожения. Результаты в режиме реального времени могут быть отформатированы различными способами, а также экспортироваться для дальнейшего анализа. Этот участок кумулятивного распределения диаметра клеток S.Cerevisiae создается на основе данных, проанализированных с помощью этой техники.Он демонстрирует автоматическое распознавание клеток в состоянии различать начинающие и не подающий надежды клетки. Твердая кривая является распределение во время выращивания в три часа. Пунктирная кривая – это распределение одного и того же культивирования в семь часов.Разбитая кривая представляет данные, собранные в 13 часов. Процедура аннотации занимает много времени, но она является ключом к достижению желаемой точности идентификации ячейки. С помощью этой процедуры, если время измерения короче, чем динамика процесса, измерение в режиме реального времени может быть использовано для управления процессом.Этот метод прокладывает путь для использования измерения неоднородности популяции в качестве параметра процесса выращивания микробов от ранних этапов разработки процесса до производственного масштаба.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Видео-курс сканирующей конфокальной микроскопии и Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Количественная оценка глобальной диастолической функции по кинематическая Моделирование на основе анализа трансмитрального кровотока через Заполнение формализма Параметризованный диастолической

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Универсальный ручной трехмерной оптико-акустической визуализации зонд для Deep Tissue человека ангиографии и функциональных доклинических исследований в режиме реального времени

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Роман Атомно-силовая микроскопия на основе Биопэннинг для изоляции морфологии специфических реагентов против TDP-43 варианты, в амиотрофического латерального склероза

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Измерение ТКР ПКИКЖ Связывание<em&gt; На месте</em&gt; С помощью FRET основе микроскопии Пробирной

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...