Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Författarna är tacksamma för stödet från det tyska federala ministeriet för ekonomi och energi inom ramen ZIM-Koop, projektet "Smart process Inspection", Grant No. ZF 4184201CR5.

Anmärkning: följande steg är nödvändiga för att anpassa parametrarna till respektive mikroorganism och odlingsförhållanden. Justeringen av avsöknings inställningarna varar ca 20 min för en erfaren användare. En detaljerad beskrivning av verktyg och steg ges i motsvarande sond manual från SOPAT GmbH. I allmänhet behövs de verktyg som presenteras i följande protokoll: (i) sond Controller för sond justeringar och bild förvärv; (II) Fiji (ImageJ) för anteckningar om förvärvade bilder; ...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

ISM som presenteras här med samma eller mycket liknande anordningar användes för att mäta morfologisk dynamik av svampar, mikroalger, och jästceller, vilket möjliggjorde bestämning av tillväxt aktivitet, och i händelse av alger, intracellulär produkt ackumulering. Sensorn har inga rörliga delar och är direkt tillämplig i någon vanlig omrörd tank bioreaktor, antingen genom en standard port eller i en steriliserbar by-pass. Eftersom jäst är mycket mindre än alger, minskning av Cellstorlek krävde några n...

Morfologiska egenskaper hos celler är ofta relaterade till fysiologiska tillstånd, en koppling mellan form och funktion finns för många program. Morfologin av en enda cell påverkas av tillståndet av tillväxt, cellens ålder, osmotiska och andra potentiella cellspänningar eller produkt ackumulering. Morfologiska förändringar av celler är ofta ett mått på tillväxt livskraften i en kultur. Intracellulär produkt syntes, lipid ackumulering i alger och inkludering organ formation i bakterier, bland annat, är relaterade med cellstorleken samt. Cell tätorten kan vara en annan faktor som är värt att utreda som sammanfattas nyligen2.
Befolknings heterogen kan kvantifieras baserat på morfologiska egenskaper hos enskilda celler. Studier visade att heterogenitet inom en kultur kan vara betydande, till exempelunder storskaliga produktionsvillkor3 den totala avkastningen kan påverkas av en låg prestanda av subpopulationer4.
Vanligtvis utförs bedömningen av cellernas morfologiska egenskaper genom manuell provtagning eller med en flödes kammare kopplad till en fotooptisk enhet. Detta leder till flera restriktioner: den begränsade mängden förvärvade data kan knappast ge statistiskt tillförlitliga mätningar; tidsfördröjningen mellan provtagning och resultatens tillgänglighet kan vara för lång i jämförelse med processens dynamik. och viktigast av allt är att provtagningsförfarandet (provtagnings hamnens lokalisering, förbehandling av provet före mätningen, ogynnsamma förhållanden i provtagnings-eller bypass-röret) kan utlösa ett partiskt fel eftersom själva urvalsförfarandet redan kan påverka cell Morfologi. Slutligen finns det alltid en hög risk för kontaminering under provtagning eller i by-pass lösningar, om de inte är steriliserbara på plats.
Tillämpningen av in situ -mikroskopi (ISM) kan kringgå flera av dessa problem. Om celler upptäcks automatiskt kan en korrekt identifiering av deras morfologiska egenskaper undersökas5. Fram till nu var de huvudsakliga begränsningarna i denna metod (i) utvärderingstiden för bilder, som var för lång för in situ -tillämpningar, och (II) den dåliga upplösningen av bilder, särskilt vid höga cell tätheter. Även om de första lösningarna av ISM inkluderade Mekanisk provtagning, utspädning av sonden, eller begränsades till ett by-pass system6,7, ytterligare metoder tillåta avskiljning av cellsuspensionen direkt8.
De senaste framstegen inom ISM gör det möjligt att i linje eller på rad övervaka celler på en enda cell basis, vilket ger fördelningen av morfologiska parametrar i realtid direkt i cellsuspensioner vid betydligt höga cellkoncentrationer. Genom off line analyser av cellernas nyckelparametrar kan korrelationer med information som tillhandahålls av den kopplade automatiserade cell detekteringen och ISM identifieras. Sedan, nya mjuk sensor design uppnås, där en omätbar parameter uppskattas med Single-cell morfologi.
I denna rapport, ISM utförs genom att koppla en foto optisk sond till en automatiserad bildanalys. ISM består av en enda stång sensor sond som gör det möjligt att fånga bilder inom ett känt fokusområde i ett justerbart mått Gap med en högupplöst CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) och MM 2,1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Blixt belysningen leds av transmission. Därför kommer ljuset från motsatt sida av kameran9 och dess intensitet kan justeras. Celler passerar kontinuerligt genom denna lucka med vätskeflödet. Därför erhålls en representativ prov population. Sonden kan monteras direkt på bio reaktorn så att den når in i cellsuspensionen, eller den kan användas i en steriliserbar by-pass. Sensor skalet är anslutet till systemet före sterilisering, de optiska delarna monteras efteråt i skalet.
Fram till nu, relevanta industriella mikroorganismer, t. ex., trådformiga svampar (diameter på upp till över 200 μm), den heterotrofiska mikroalger Crypthecodinium cohnii (genomsnittlig cell diameter på 20 μm), och jästen Saccharomyces cerevisiae (genomsnittlig cell diameter av 5 μm), undersöktes med denna eller liknande enheter, som kort beskrivas.
Filamentösa svampar tenderar att bilda pellets under vissa odlingsförhållanden. Dessa är av en storleksanpassa av upp till flera hundra μm. Den hyfer av svampceller utveckla olika längder i beroendet av den hydrodynamiska stressen i vätskefasen. Detta har en inverkan på metabolisk och tillväxt aktivitet, substrat upptag och produkt release. ISM tillämpades för att identifiera pellets storleksfördelning och bredden av zoner med lägre biomassa densitet vid kanterna av pellets (egna opublicerade data).
Storleken på C. cohnii förändrar mellan 15 och 26 μm när cellerna ackumuleras den fleromättade fettsyran dokosahexaensyra (DHA) under kväve begränsning. Denna bioteknologiska DHA produktionsprocess består av två delar, tillväxtfasen, där cellerna delar sig och blir mindre, och produktionsfasen, där celler ackumulerar produkten och därmed blir större. Därför användes cellstorleken för att bestämma process tillståndet, där antingen tillväxten eller DHA-produktionen var gynnsam. Slutligen hittades ett samband mellan cellstorleken och DHA-innehållet. I detta fall, ISM gör det möjligt att övervaka den intracellulära DHA ackumulering i realtid utan krav på provtagning, cell störningar, och den gemensamma gaskromatografi analys10.
Spirande jäst är vanligtvis av en storlek mellan 3 och 8 μm. Andelen celler som är i mogningen tillstånd i taget, som beskrivs med spirande index (BI), ger information om tillväxt vitalitet11,12, och även en relation med rekombinant protein sekretion har bevisats13. Med hjälp av ISM var blivande och icke-spirande jästceller (celler med och utan knopp) distingerade14. Stress villkor kan också leda till en bredare variation av Cellstorlek inom en jäst population, som nyligen visas i skala ner odlingar, där villkoren för storskalig näringsämne-begränsad Fed-batch odlingar härmade3.
Därför har ISM potential att övervaka tillväxt vitalitet och produkt bildning på en enda cellnivå under alla stadier av en Bioprocess för identifiering av optimala odlingsförhållanden, eller för ändamålet med processtyrning. De metoder som beskrivs här är inriktade på mikrobiella tillämpningar med enstaka celler, men är också tillämpliga på större partiklar som mänskliga och animaliska celler, cell agglomerater och pellets av trådformiga organismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

In situ övervakning i mikrobiella bioprocesser är oftast begränsad till kemiska och fysikaliska egenskaper hos mediet (t. ex.pH-värde och upplöst syrekoncentration). Ändå kan morfologin av celler vara en lämplig indikator för optimala förhållanden, eftersom det förändras med beroende av tillväxt tillstånd, produkt ackumulering och cell stress. Dessutom ger encellig storleksfördelning inte bara information om odlingsförhållandena, utan också om befolkningens heterogenitet. För att få sådan information utvecklades en fotooptisk in situ -mikroskopi enhet1 för att möjliggöra övervakning av encelliga storleksfördelning direkt i cellsuspensionen i bioreaktorer. En automatiserad bildanalys är kopplad till mikroskopi baserat på en neurala nätverk modell, som är utbildad med användare-kommenterade bilder. Flera parametrar, som erhålls från fångar av mikroskopet, är korrelerade att bearbeta relevanta funktioner i cellerna, som deras metabolisk aktivitet. Fram till nu, den presenterade in situ mikroskopi sond serien tillämpades för att mäta pelleten storlek i trådformiga svampar suspensioner. Det användes för att skilja Single-cellstorlek i mikroalger odling och relatera det till lipid ackumulering. Formen på cellulära partiklar var relaterad till spirande i jästkulturer. Mikroskopi analys kan i allmänhet delas upp i tre steg: (i) bild förvärv, (II) partikel identifiering, och (III) dataanalys, respektive. Alla steg måste anpassas till organismen, och därför krävs specifik kommenterade uppgifter för att uppnå tillförlitliga resultat. Förmågan att övervaka förändringar i cellmorfologi direkt i linje eller på rad (i en by-pass) möjliggör realtidsvärden för övervakning och kontroll, i processutveckling samt i produktionsskala. Om off line data korrelerar med realtidsdata, den nuvarande tråkiga off linje mätningar med okända influenser på cellstorleken blir onödigt.

Cell storleks upptäckten i jästkulturer med ISM och automatiserad bild detektering för att skilja mellan spirande och icke-knoppade celler genomfördes framgångsrikt. Både stroboskopintensiteten och valet av mät gap har en rad tolerans, där partikel identifieringen inte påverkas. Till exempel, S. cerevisiae celler mättes med olika stroboskop intensiteter inom ett variationsintervall på 11% vid en torr biomassa koncentration av 4 g L-1. Motsvarande bilder gav ...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

En foto-optisk in situ mikroskopi enhet utvecklades för att övervaka storleken på enskilda celler direkt i cellsuspensionen. Realtids mätningen utförs genom att koppla den foto optiska steriliserbara sonden till en automatiserad bildanalys. Morfologiska förändringar visas med beroende av tillväxt tillstånd och odlingsförhållanden.

In situ Mikroskopi för real tids bestämning av encellig morfologi i bioprocesser

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor av befolkningen heterogenitet genom morfologiska bedömning av cellerna. In situ mikroskopi tillåter studie odling villkor, process avkastning, och produktkvalitet. Den största fördelen med denna teknik är en in situ-mätning, som ger realtidsdata utan provtagning eller medföra risk för kontaminering.In situ-mikroskopi kopplade till automatiserad bildigenkänning kan ge ytterligare information om cellulära strukturer, form, och cell gytter bortom storlek. Det är också möjligt att mäta cellkoncentrationer. Metoden har visat sig vara ett pålitligt verktyg.Ingen alternativ metod ger samma information på så kort tid och låg ansträngning för provberedning. Metoden har anpassats till olika bioprocesser och mikroorganismer, SEG fintrådiga svampar, mikro-allergi, och jäst. Sonden används tillsammans med en dator.Hårdvaran består av en enda stavsond med högupplöst CCD-kamera. Celler som passerar genom ett justerbart mätgap avbildas av kameran. Ljus kommer in i gapet mittemot kameran, vilket innebär belysning är genom överföring.Ställ in maskinvaruparametrarna med hjälp av cellkoncentrationer som sträcker sig över det förväntade intervallet. Börja göra förberedelser för offlinemätningar. Använd en tjockleksmätare för att justera måttgapet.Vrid sedan sondskruvmuttern för att ställa in mätgapet till fem eller tio gånger den maximala förväntade celldiametern. Öppna programvaran för probestyrenheten vid datorn. I programvaran väljer du önskad sond och går till sektionsåtgärder.Tryck sedan på Anslut. Därefter går du till fliken Avsökningskontroll och öppnar den. Starta videostreaming genom att trycka på uppspelningsknappen.Fixera sonden på ett stativ och utför följande steg för varje mätning. Arbeta med sonden och spraya etanol i mätspalten. Torka försiktigt bort eventuellt damm eller smuts med optiskt papper.Vid datorn använder du livevisning för att kontrollera att glaset på sensorn är fritt från partiklar. Därefter placerar du ett torrt optiskt papper i mätgapet för fokusering. Vrid bindningsskruven för att flytta fokus manuellt.Sluta fokusera när enstaka fibrer av papperet i mätgapet syns tydligt. Nu, få ett rör fyllt med kulturbuljong. Doppa mikroskopet i buljongen, så gapet är helt täckt med cell suspension.Använd bindskruvarna för att finjustera fokus på cellerna. När denna fokusering är gjort, ändra inte det igen under experimentet. Återgå till programvaran för experimentet.Gå till menyn Utlösande. Ställ in bildrutefrekvensen under menyn Utlösande. En hertz rekommenderas för offlinemätningar.Därifrån går du till fältet Ramar per utlösare och ställer in det som nödvändigt för bra statistik. Här, omkring 200. Gå också till menyn Allmänt.Där väljer du den katalog som bilderna ska sparas i. Påbörja bildförvärv med knappen Startbild utlösande förvärv. Flytta försiktigt röret för att inducera flöde i mätgapet.Använd bilderna från den första körningen av experimentet som en träningsuppsättning. Har öppen källkod Fiji redo och släppa bilderna från experimentet i sitt fönster. När klar, välj Analysera, följt av Verktyg, sedan ROI Manager.Därefter väljer du ett markeringsverktyg. I bilden, besluta om en partikel för att kommentera som är i fokus. Rita en cirkel runt den med markeringsverktyget.Tryck på Lägg till om du vill lägga till annoteringen i ROI-hanteraren. Därefter väljer du ett penselverktyg och väljer en lämplig pixelstorlek. Använd penselverktyget för att förfina markeringen.Fortsätt att markera alla objekt av intresse på samma sätt på cirka 15 bilder. Spara de kommenterade filerna och använd dem som träningsuppsättning. När igenkänningsalgoritmen tränas och är klar använder du den för att visualisera resultat.Gå till Arkiv i Results Analyzer, följt av Importfil. Där väljer du önskad resultatfil. Fortsätt genom att trycka på knappen Skapa diagram.Välj Distributionsdiagram. Detta kommer att visa den morfologiska fördelningen av kulturen. Återgå till Skapa diagram för att välja Känslighetsdiagram.Informationen som visas kan hjälpa till att avgöra hur många celler som måste analyseras för att få önskad noggrannhet. Utför onlinemätningar efter att ha slutfört offlinemätningar. För onlinemätningar, anslut sonden direkt till en bioreaktor.När du är ansluten, sterilisera monteringen ordentligt. Välj Övervakning i instrumentpanelen. Det finns en uppspelningsknapp för att starta bildförvärv och en stoppknapp för att avsluta den.Tryck på uppspelningsknappen. Vid bioreaktorn, börja inympning av kulturen. Kameran kommer att fånga video av cellerna och automatiskt identifiera dem för analys.Övervakningen ger onlinedata av cellstorlekar och former av olika cellmorfologier under hela jäsningen. Realtidsresultaten kan formateras på olika sätt och även exporteras för vidare analys. Denna plot av kumulativa fördelningar av S.Cerevisiae cell diameter skapas från data analyseras med hjälp av denna teknik.Det visar den automatiska celligenkänning kan skilja spirande och icke-spirande celler. Den fasta kurvan är fördelningen under en odling vid tre timmar. Den prickade kurvan är fördelningen av samma odling vid sju timmar.Den streckade kurvan representerar data som samlas in vid 13 timmar. Annoteringsproceduren är tidskrävande, men det är nyckeln för att uppnå önskad noggrannhet för cellidentifieringen. Med denna procedur, om mättiderna är kortare än processdynamiken, är realtidsmätningen kunna användas för processkontroll.Denna teknik banar väg för att använda mätningen av populationsheterogenitet som en processparameter för mikrobiella odlingar från de tidiga processutvecklingsstegen till produktionsskalan.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Scanning konfokalmikroskopi och Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifiering av Global diastoliska funktionen av kinematisk modellering baserad Analys av Transmitral Flow via Parametrized diastoliska Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Handhållna Tredimensionell optoakustisk Imaging Probe för djup vävnad Human angiografi och funktionella Prekliniska studier i realtid

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Använda Cell-substrat Impedans och levande cell imaging att mäta Realtids Förändringar i Cellular Adhesion och De-vidhäftning inducerad av Matrix Ändring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning för Isolering av morfologi Särskilda reagenser mot TDP-43 varianter i amyotrofisk lateralskleros

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Mätt TCR-pMHC Bindning<em&gt; In Situ</em&gt; Med en FRET-baserad Mikroskopi analys

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Ett protokoll för realtid 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En ultrahög kapacitet mikroflödessystem plattform för Single-cell Genomsekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...