Name: in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

Yazarlar çerçevesinde ZIM-Koop, proje "Akıllı Süreç Denetimi" kapsamında Almanya Federal Ekonomi ve Enerji Bakanlığı desteği için müteşekkir, hibe hayır. ZF 4184201CR5.

NOT: Parametreleri ilgili mikroorganizma ve kültür koşullarına uyarlamak için aşağıdaki adımlar gereklidir. Sonda ayarlarının ayarını deneyimli bir kullanıcı için yaklaşık 20 dakika sürer. Araç ve adımların ayrıntılı bir açıklaması SOPAT GmbH'nin ilgili prob kılavuzunda verilmiştir. Genel olarak, aşağıdaki protokolde sunulan araçlara ihtiyaç vardır: (i) Prob ayarlamaları ve görüntü edinimi için Prob Denetleyicisi; (ii) Elde edilen görüntülerle ilgili ek açıklamalar i...

<ol>
	<li>Maa&#223;, S., Rojahn, J., H&#228;nsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems.">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers &amp; Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li><li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions.">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations.">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li><li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis.">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li><li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring.">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).</li><li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy:+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring.">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li><li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line,+flow-through+microscopy.">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li><li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics.">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).</li><li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maa&#223;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions:+Applications+in+Research+and+Industry.">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy.">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li><li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level.">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts.">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vol.+P2.+Prozessmesstechnik.">Vol. P2. Prozessmesstechnik.</a> , 222-225 (2017).</li><li>Marb&#224;-Ard&#233;bol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy.">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).</li><li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., D&#252;sterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy.">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li><li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations.">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li><li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy:+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress.">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li><li>B&#246;hm, A., &#220;cker, A., J&#228;ger, T., Ronneberger, O., Falk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOODL:+Instance+segmentation+of+overlapping+biological+objects+using+deep+learning.">ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning.</a> , 1225-1229 (2018).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing.">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li><li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control.">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li><li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development.">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li></ol>

Burada aynı veya çok benzer cihazlarla sunulan ISM, mantarların, mikroalgların ve maya hücrelerinin morfolojik dinamiklerini ölçmek için kullanılmış, bu da büyüme aktivitesinin belirlenmesini ve alglerin hücre içi ürün birikimine yol açarak sağlanmıştır. Sensörün hareketli parçaları yoktur ve standart bir bağlantı noktası üzerinden veya sterilize edilebilir bir by-pass'ta herhangi bir standart karıştırılan tank biyoreaktöründe doğrudan uygulanabilir. Maya yosun çok daha küçük oldu...

Hücrelerin morfolojik özellikleri genellikle fizyolojik durum ile ilgilidir, form ve fonksiyon arasında bir bağlantı birçok uygulama için var. Tek bir hücrenin morfolojisi büyüme durumu, hücrenin yaşı, ozmotik ve diğer potansiyel hücre gerilmeleri veya ürün birikimi nden etkilenir. Hücrelerin morfolojik değişiklikleri genellikle bir kültürün büyüme canlılığının bir ölçüsüdür. Hücre içi ürün sentezi, yosunlarda lipid birikimi ve bakterilerde dahil vücut oluşumu, diğerlerinin yanı sıra, hücre büyüklüğü ile de ilişkilidir. Hücre aglomerasyonu son zamanlarda özetlendiği gibi araştırmaya değer başka bir faktör olabilir2.
Popülasyon heterojeniteleri tek tek hücrelerin morfolojik özelliklerine göre ölçülebilir. Çalışmalar bir kültür içinde heterojenlik önemli olabileceğini gösterdi, örneğin,büyük ölçekli üretim koşulları altında3 genel verim alt popülasyonların düşük bir performans etkilenebilir4.
Genellikle, hücrelerin morfolojik özelliklerinin değerlendirilmesi manuel örnekleme veya bir foto-optik cihaza bağlı bir by-pass akış odası ile gerçekleştirilir. Bu çeşitli kısıtlamalara yol açar: elde edilen verilerin sınırlı miktarda neredeyse istatistiksel olarak güvenilir ölçümler sağlayabilir; örnekleme arasındaki zaman gecikmesi ve sonuçların erişilebilirliği sürecin dinamiklerine kıyasla çok uzun olabilir; ve en önemlisi, örnekleme prosedürü (numune portunun konumu, ölçümden önce numunenin ön işlemesi, örnekleme veya bypass tüpündeki elverişsiz koşullar) örnekleme işleminin kendisi hücreyi etkileyebileceğinden önyargılı bir hatayı tetikleyebilir Morfolojisi. Son olarak, numune alma sırasında veya by-pass çözeltilerinde sterilize edilebilen çözeltilerde her zaman yüksek kontaminasyon riski vardır.
in situ mikroskopi (ISM) uygulaması bu sorunların birkaçını atlatabilir. Hücreler otomatik olarak algılanırsa, morfolojik özelliklerinin doğru bir şekilde tanımlanması5. Şimdiye kadar, bu yöntemin ana sınırlamaları (i) yerinde uygulamalar için çok uzun olan görüntülerin değerlendirme süresi ve (ii) görüntülerin kötü çözünürlüğü, özellikle yüksek hücre yoğunluklarında idi. ISM'nin ilk çözümleri mekanik örnekleme dahil olmasına rağmen, prob seyreltme, ya da bir by-pass sistemi ile sınırlı ydı6,7, daha fazla yaklaşımlar doğrudan hücre süspansiyon yakalama sağlar8.
ISM'deki son gelişmeler, tek hücreli olarak hücrelerin satır içi veya satır da izlenmesine olanak sağlar, bu da morfolojik parametrelerin gerçek zamanlı olarak doğrudan hücre süspansiyonlarında önemli ölçüde yüksek hücre konsantrasyonlarında dağılımını sağlar. Hücrelerin anahtar parametrelerinin çevrimdışı analizleri sayesinde, birleşen otomatik hücre tespiti ve ISM tarafından sağlanan bilgilerle korelasyon lar tanımlanabilir. Daha sonra, tek hücreli morfolojisi ile ölçülemez bir parametrenin tahmin edildiği yeni yumuşak sensör tasarımları elde edilir.
Bu raporda, ISM otomatik bir görüntü analizi için bir foto-optik prob kaplayarak yapılır. ISM, yüksek çözünürlüklü CCD kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) ve MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)]] ile ayarlanabilir bir ölçüm boşluğunda bilinen bir odak aralığındaki görüntülerin yakalanmasını sağlayan tek çubuklu bir sensör probundan oluşur. Flaş ışığı aydınlatması iletim ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, ışık kamera9 karşı tarafında kaynaklanır ve yoğunluğu ayarlanabilir. Hücreler sıvı akışı ile bu boşluktan sürekli olarak geçerler. Bu nedenle, temsili bir örnek popülasyon elde edilir. Prob doğrudan biyoreaktöre monte edilebilir, böylece hücre süspansiyonuna ulaşır veya sterilize edilebilir bir by-pass'ta kullanılabilir. Sensör kabuğu sterilizasyondan önce sisteme bağlanır, optik parçalar daha sonra kabuk içine monte edilir.
Şimdiye kadar, ilgili endüstriyel mikroorganizmalar, örneğin,ipliksi mantarlar (çapı 200 μm'ye kadar), heterotrofik mikroalg Crypthecodinium cohnii (ortalama hücre çapı 20 μm) ve maya Saccharomyces cerevisiae (ortalama hücre çapı 5 μm), kısa bir süre açıklanan bu veya benzeri cihazlarla incelenmiştir.
Filamentöz mantarlar belirli yetiştirme koşulları altında pelet oluşturma eğilimindedir. Bunlar birkaç yüz μm boyutundadır. Mantar hücrelerinin hyphae sıvı fazhidrodinamik strese bağımlılık farklı uzunluklarda geliştirmek. Bu metabolik ve büyüme aktivitesi üzerinde bir etkisi vardır, substrat alımı ve ürün salınımı. ISM pelet boyutu dağılımı ve pelet kenarlarında düşük biyokütle yoğunluğu bölgelerin in genişliğini belirlemek için uygulandı (kendi yayınlanmamış veri).
C. cohnii boyutu hücreleri azot sınırlaması altında çoklu doymamış yağ asidi dokosaheksaenoik asit (DHA) birikir zaman 15 ve 26 μm arasında değişir. Bu biyoteknolojik DHA üretim süreci iki bölümden oluşur, büyüme aşaması, hangi hücrelerin bölmek ve küçülür, ve üretim aşaması, hangi hücrelerin ürün birikir ve böylece daha büyük olur. Bu nedenle, hücre boyutu, büyüme veya DHA üretiminin olumlu olduğu işlem durumunu belirlemek için kullanılmıştır. Son olarak, hücre boyutu ve DHA içeriği arasında bir korelasyon bulundu. Bu durumda ISM, hücre içi DHA birikimini örnekleme, hücre bozulması ve ortak gaz kromatografisi analizi10gerekkalmadan gerçek zamanlı olarak izlemenizi sağlar.
Tomurcuklanan maya genellikle 3 ila 8 μm arasında bir boyuttadır. Tomurcuklanma indeksi (BI) ile açıklandığı gibi, bir anda olgunlaşma durumunda olan hücrelerin oranı, büyüme canlılığı hakkında bilgi sağlar11,12, ve hatta rekombinant protein salgısı ile bir ilişkikanıtlanmıştır 13. ISM yardımıyla, tomurcuklanan ve tomurcuklanmayan maya hücreleri (tomurcuklu ve tomurcuksuz hücreler)14ayırt edildi. Stres koşulları da bir maya popülasyoniçinde hücre boyutunun daha geniş bir varyasyon yol açabilir, son zamanlarda küçültülmüş ekimleri gösterildiği gibi, hangi büyük ölçekli besin sınırlı beslenen-toplu yetiştirme koşulları taklit edildi3.
Bu nedenle, ISM optimum yetiştirme koşullarının belirlenmesi için bir biyosürecin tüm aşamalarında tek hücre düzeyinde büyüme canlılığı ve ürün oluşumunu izlemek için potansiyele sahiptir, ya da süreç kontrolü amacıyla. Burada açıklanan yöntemler tek hücreli mikrobiyal uygulamalara odaklanmıştır, ancak insan ve hayvan hücreleri, hücre aglomeraları ve ipliksi organizmaların peletleri gibi daha büyük parçacıklar için de geçerlidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor MM 2.1 - MFC</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware version v1R.003.0092</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thickness gauge</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>n.n.</td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOPAT manual Version 2.0.5</td>
			<td>SOPAT GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical lense paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji, ImageJ</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>It can be any supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ microscopy for real-time determination of single-cell morphology in bioprocesses

Mikrobiyal biyoproseslerde yerinde izleme çoğunlukla ortamın kimyasal ve fiziksel özellikleriyle sınırlıdır(örn.pH değeri ve çözünmüş oksijen konsantrasyonu). Bununla birlikte, hücrelerin morfolojisi en uygun koşullar için uygun bir gösterge olabilir, çünkü büyüme durumuna bağımlılık ile değişir, ürün birikimi ve hücre stresi. Ayrıca, tek hücreli boyut dağılımı sadece yetiştirme koşulları hakkında değil, aynı zamanda nüfus heterojenliği hakkında da bilgi sağlar. Bu tür bilgileri elde etmek için, biyoreaktörlerde tek hücreli boyut dağılımının doğrudan hücre süspansiyonunda izlenmesini sağlamak için situ mikroskopi cihazı1 foto-optik geliştirilmiştir. Otomatik görüntü analizi, kullanıcı açıklamalı görüntülerle eğitilmiş bir sinir ağı modeline dayalı mikroskopiile birleştirilir. Mikroskobun ele geçirilmesinden elde edilen çeşitli parametreler, metabolik aktivite gibi hücrelerin ilgili özellikleriyle ilişkilidir. Şimdiye kadar, ipliksi mantar süspansiyonlarında pelet boyutunu ölçmek için situ mikroskopi prob serisi sunulmuştur. Mikroalg yetiştiriciliğinde tek hücreli boyutu ayırt etmek ve lipid birikimi ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Hücresel parçacıkların şekli maya kültürleri tomurcuklanma ile ilgiliydi. Mikroskopi analizi genellikle üç adıma ayrılabilir: (i) görüntü edinimi, (ii) parçacık tanımlama ve (iii) veri analizi, sırasıyla. Tüm adımlar organizmaya adapte edilmelidir ve bu nedenle güvenilir sonuçlar elde etmek için özel açıklamalı bilgi gereklidir. Hücre morfolojisindeki değişiklikleri doğrudan satır veya satır (by-pass olarak) izleme yeteneği, süreç geliştirme de ve üretim ölçeğinde izleme ve kontrol için gerçek zamanlı değerler sağlar. Çevrimdışı veriler gerçek zamanlı verilerle ilişkiliyse, hücre boyutu üzerinde bilinmeyen etkilere sahip geçerli sıkıcı çevrimdışı ölçümler gereksiz hale gelir.

Ism ile maya kültürlerde hücre büyüklüğü algılama ve tomurcuklanma yanran olmayan hücreleri ayırt etmek için otomatik görüntü algılama başarıyla yapılmıştır. Hem strobkop yoğunluğu hem de ölçüm boşluğu seçimi, parçacık tanımlamasının etkilenmediği bir tolerans aralığına sahiptir. Örneğin, S. cerevisiae hücreleri 4 g L-1kuru biyokütle konsantrasyonunda %11'lik bir varyasyon aralığında çeşitli stroboskop yoğunlukları ile ...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses at JoVE.com

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Bir foto-optik in situ mikroskopi cihazı doğrudan hücre süspansiyon tek hücrelerin boyutunu izlemek için geliştirilmiştir. Gerçek zamanlı ölçüm, foto-optik sterilize edilebilir probun otomatik görüntü analizine dahil edilerek gerçekleştirilir. Morfolojik değişiklikler büyüme durumuna ve yetiştirme koşullarına bağımlılıkla birlikte ortaya çıkmaktadır.

In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Bu yöntem, hücrelerin morfolojik değerlendirmesi ile popülasyon heterojenitesinin temel sorularının yanıtlatına yardımcı olabilir. In situ mikroskopi çalışma yetiştirme koşulları, proses verimleri ve ürün kalitesi sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, örnekleme veya kontaminasyon riski getirmeden gerçek zamanlı veri sağlayan yerinde ölçümdür.Situ mikroskobu otomatik görüntü tanıma ile birleştiğinde hücresel yapılar hakkında ek bilgi sağlayabilir, şekil, ve boyutu ötesinde hücre aglomerasyonu. Hücre konsantrasyonlarını ölçmek de mümkündür. Yöntem güvenilir bir araç olduğu kanıtlanmıştır.Hiçbir alternatif yöntem bu kadar kısa sürede aynı bilgiyi ve numune hazırlama için düşük çaba yı sağlar. Bu yöntem çeşitli biyoproseslere ve mikroorganizmalara, SEG ipliksi mantarlara, mikro alerjiye ve mayaya uyarlanmıştır. Sonda bir bilgisayarla birlikte kullanılır.Donanım, yüksek çözünürlüklü CCD kameraya sahip tek bir çubuk sondadan oluşur. Ayarlanabilir bir ölçüm boşluğundan geçen hücreler kamera tarafından görüntülenir. Işık kameranın karşısındaki boşluğa girer, yani aydınlatma iletimle yapılır.Beklenen aralığı kapsayan hücre konsantrasyonları kullanarak donanım parametrelerini ayarlayın. Çevrimdışı ölçümler için hazırlıklar yapmaya başlayın. Ölçüm boşluğunu ayarlamak için bir kalınlık ölçer kullanın.Daha sonra ölçüm boşluğunu beklenen maksimum hücre çapının beş veya 10 katına ayarlamak için probu vida somunu çevirin. Bilgisayarda, sonda denetleyici yazılımını açın. Yazılımda, istenen sondayı seçin ve bölüm eylemlerine gidin.Ardından Bağlan'a basın. Ardından, Sonda Denetimi sekmesine gidin ve açın. Oynat düğmesine basarak video akışını başlatın.Sondayı bir tripoda sabitle ve her ölçüm için aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Ölçüm boşluğunda prob ve sprey etanol ile çalışın. Optik kağıtla toz veya kiri dikkatlice silin.Bilgisayarda, sensörün cam Parçacıkları ücretsiz olup olmadığını kontrol etmek için canlı görünümü kullanın. Ardından, odaklama için ölçüm boşluğuna kuru bir optik kağıt yerleştirin. Odak noktasını manuel olarak hareket ettirmek için bağlama vidasını çevirin.Ölçüm boşluğundaki kağıdın tek lifleri açıkça görüldüğünde net bir şekilde net bir şekilde netlemeyi bırakın. Şimdi, kültür suyuyla dolu bir tüp getir. Mikroskobu et suyuna batırın, böylece boşluk hücre süspansiyonuyla tamamen kaplanır.Hücrelere odaklanmaya ince ayar yapmak için bağlama vidalarını kullanın. Bu odaklama yapıldıktan sonra, deneme sırasında tekrar değiştirmeyin. Deneme için yazılıma geri dönün.Tetikleyici menüsüne gidin. Tetikleyici menüsünün altında kare hızını ayarlayın. Çevrimdışı ölçümler için bir hertz önerilir.Buradan, Tetik Başına Kareler alanına gidin ve iyi istatistikler için gerekli olarak ayarlayın. İşte, yaklaşık 200. Ayrıca, Genel menüye gidin.Burada, görüntülerin kaydedilen dizinini seçin. Görüntü Edinme başlat düğmesiyle görüntü edinimine başlayın. Ölçü boşluğunda akışı sağlamak için tüpü yavaşça hareket ettirin.Denemenin ilk çalışmasındaki görüntüleri bir eğitim kümesi olarak kullanın. Açık kaynak yazılım Fiji hazır ve penceresinde deneme görüntüleri bırakın. Bittiğinde, Analiz et, ardından Araçlar'ı ve ardından YG Yöneticisi'ni seçin.Ardından, bir seçim aracı seçin. Resimde, odak ta bir açıklama yapmak için bir parçacık karar verin. Seçim aracıyla etrafında bir daire çizin.YG Yöneticisi'ne ek açıklama eklemek için Ekle'ye basın. Ardından, bir fırça aracı seçin ve uygun bir piksel boyutu seçin. Seçimi hassaslaştırmak için fırça aracını kullanın.Yaklaşık 15 görüntüde tüm ilgi çekici nesneleri aynı şekilde işaretlemeye devam edin. Açıklamalı dosyaları kaydedin ve bunları bir eğitim kümesi olarak kullanın. Tanıma algoritması eğitildiğinde ve hazır olduğunda, sonuçları görselleştirmek için kullanın.Sonuç Çözümleyicisi'nde Dosya'ya gidin ve ardından Dosyayı Aktarın. Burada, istenen sonuç dosyasını seçin. Grafik Oluştur düğmesine basarak devam edin.Dağıtım Grafiği'ni seçin. Bu kültürün morfolojik dağılımını gösterecektir. Duyarlılık Çizimi'ni seçmek için Grafik Oluştur'a dönün.Görüntülenen bilgiler, istenen doğruluğu elde etmek için kaç hücrenin analiz edilmesi gerektiğini belirlemeye yardımcı olabilir. Çevrimdışı ölçümleri tamamladıktan sonra çevrimiçi ölçümler gerçekleştirin. Çevrimiçi ölçümler için, sondayı doğrudan bir biyoreaktöre bağlayın.Bağlandıktan sonra, düzgün montaj sterilize. Panoda İzleme'yi seçin. Görüntü edinimi başlatmak için bir oynatma düğmesi ve bunu sona erdirmek için bir dur düğmesi vardır.Oynat düğmesine basın. Biyoreaktörde, kültürün aşılanmasına başlayın. Kamera hücrelerin video yakalayacak ve otomatik olarak analiz için bunları tanımlamak.İzleme, tüm fermantasyon sırasında farklı hücre morfolojilerinin hücre boyutları ve şekillerinin çevrimiçi verilerini sağlar. Gerçek zamanlı sonuçlar çeşitli şekillerde biçimlendirilebilir ve daha fazla analiz için dışa aktarılabilir. S.Cerevisiae hücre çapının kümülatif dağılımlarının bu çizimi bu teknik kullanılarak analiz edilen verilerden oluşturulmuştur.Bu otomatik hücre tanıma tomurcuklanma ve tomurcuklanmayan hücreleri ayırt edebiliyoruz gösterir. Katı eğri üç saat bir ekim sırasında dağılımıdır. Noktalı eğri yedi saat aynı ekimi dağılımıdır.Kesikli eğri, 13 saat içinde toplanan verileri temsil eder. Ek açıklama yordamı zaman alıcıdır, ancak hücre tanımlaması için istenen doğruluğu elde etmek için anahtardır. Bu yordam ile, ölçüm süreleri proses dinamikleri daha kısa ise, gerçek zamanlı ölçüm proses kontrolü için kullanılabilir.Bu teknik, erken proses geliştirme adımlarından üretim ölçeğine kadar mikrobiyal ekimler için bir proses parametresi olarak popülasyon heterojenitesinin ölçülmesinin önünü açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Evrensel Real Time Derin Doku İnsan Anjiografi ve Fonksiyonel Preklinik Çalışmalar üç boyutlu Optoacoustic Görüntüleme Probe El

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...