Name: the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af tilskud 2017-04559 fra svenske forsknings Rådet (VR) og EU støttede projekt STRANDPROMENADEN til Anders Blomberg. Især oprettelsen af de dyrkningsbaserede facilitet, gennem årene, blev støttet af tilskud til Per R. Jonsson fra de følgende finansielle organer: SSF (svenske Foundation for strategisk forskning) gennem programmet havforskning og -teknologi og MISTRA gennem programmet Marine Paint. Kent Berntsson var medvirkende i de tidlige faser af opsætning af culturingfacility. Yderligere finansiering til oprettelse af de dyrkningsbaserede facilitet er kommet fra centrum for Marine evolutionær biologi (www.cemeb.science.gu.se), som er støttet af Linnaeus tilskud fra svensk forskning råd form og VR.

<ol>
	<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , (1854).</li><li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aquaporins+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+differential+expression+in+response+to+changes+in+salinity.">Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity.</a> PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).</li><li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+alpha-subunit+of+Na+/K++ATPase+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+multiple+genes+and+differential+expression+of+alternative+splice+variants.">Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants.</a> PLoS ONE. 8, 77069 (2013).</li><li>Fyhn, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holeuryhalinity+and+its+mechanisms+in+a+cirriped+crustacean,+Balanus+improvisus.">Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).</li><li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+story+of+a+hitchhiker:+population+genetic+patterns+in+the+invasive+barnacle+Balanus+(Amphibalanus)+improvisus+Darwin+1854.">The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854.</a> PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).</li><li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+patterns+in+recruitment+and+succession+of+a+temperate+marine+fouling+assemblage:+a+comparison+of+static+panels+and+boat+hulls+during+the+boating+season.">Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season.</a> Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).</li><li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+receptors+from+the+barnacle+Balanus+improvisus.+are+activated+by+the+alpha2-adrenoceptor+agonist+medetomidine.">Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine.</a> Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).</li><li>Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+naupliar+musculature+and+a+scanning+electron+microscopy+atlas+of+nauplius+development+of+Balanus+improvisus+(Crustacea:+Cirripedia:+Thoracica).">Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica).</a> Arthropod Structure &amp; Development. 38 (2), 135-145 (2009).</li><li>Anderson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Barnacles - structure, function, development and evolution. , (1994).</li><li>Kennedy, V. S., DiCosimo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtidal+distribution+of+barnacles+in+Chesapeake+Bay,+Maryland.">Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland.</a> Estuaries. 6, 95-101 (1983).</li><li>Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+the+barnacle+settlement+pheromone:+spatial+and+ontogenetic+expression+of+the+settlement-inducing+protein+complex+of+Balanus+amphitrite.">Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).</li><li>Rittschoff, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cues+and+context:+larval+responses+to+physical+and+chemical+cues.">Cues and context: larval responses to physical and chemical cues.</a> Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).</li><li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+behavioural+rejection+of+micro-textured+surfaces+and+implications+for+recruitment+by+the+barnacle+Balanus+improvisus.">Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus.</a> Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).</li><li>Gamfeldt, L., Wall&#233;n, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+intraspecific+diversity+enhances+settling+success+in+a+marine+invertebrate.">Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate.</a> Ecology. 86, 3219-3224 (2005).</li><li>Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barnacle+in+vitro+assays+for+biologically+active+substances:+toxicity+and+settlement+inhibition+assays+using+mass+cultured+Balanus+amphitrite+amphitrite+Darwin.">Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin.</a> Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).</li><li>Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habitat+traits+and+food+availability+determine+the+response+of+marine+invertebrates+to+ocean+acidification.">Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification.</a> Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).</li><li>Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+phytoplankton+for+feeding+marine+invertebrates.">Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates.</a> Culture of marine invertebrate animals. , 22-60 (1975).</li><li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+plasticity+and+local+adaptation+for+coping+with+changing+salinity+in+coastal+areas:+a+test+case+with+barnacles+in+the+Baltic+Sea.">Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea.</a> BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).</li><li>Bacchetti De Gregoris, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+adult+barnacle+(Balanus+amphitrite)+cDNA+library+and+selection+of+reference+genes+for+quantitative+RT-PCR+studies.">Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies.</a> BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).</li><li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+insect+RNA+look+degraded.">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).</li><li>Panova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+protocols+for+whole-genome+sequencing+in+marine+organisms.">DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms.</a> Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).</li><li>Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+of+the+barnacle,+Balanus+improvisus,+to+poly(dimethylsiloxane)+fouling-release+coatings+and+poly(methyl+methacrylate)+panels:+the+effect+of+barnacle+size+on+strength+and+failure+mode.">The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode.</a> Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).</li><li>Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instantaneous+flow+structures+and+opportunities+for+larval+settlement:+barnacle+larvae+swim+to+settle.">Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle.</a> PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).</li><li>Toth, G. B., Lindeborg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-soluble+compounds+from+the+breadcrumb+sponge+Halichondria+panicea.+deter+attachment+of+the+barnacle+Balanus+improvisus.">Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus.</a> Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).</li><li>Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow-through+bioassay+for+testing+low-emission+antifouling+coatings.">A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings.</a> Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).</li><li>Walne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+food+value+of+7+species+of+algae+to+larvae+of+Ostrea+edulis+1.+Feeding+experiments.">Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments.</a> Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).</li><li>Sandnes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+and+automatic+density+control+of+large-scale+microalgal+cultures+using+near+infrared+(NIR)+optical+density+sensors.">Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors.</a> Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).</li><li>Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+proportioned:+intertidal+barnacles+alter+penis+form+to+suit+coastal+wave+action.">Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action.</a> Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).</li><li>Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+polyunsaturated+fatty+acids+from+14+species+of+diatom+(Bacillariophyceae).">Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae).</a> Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).</li><li>Jonsson, P. R., Berntsson, K., Andr&#233;, C., W&#228;ngberg, S. -. &. #. 1. 9. 7. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+growth+and+settlement+of+the+European+oyster+(Ostrea+edulis)+as+a+function+of+food+quality+measured+as+fatty+acid+composition.">Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition.</a> Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).</li><li>Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-disease+of+Portuguese+oyster+(Crassostrea+angulata.+lmk).">Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk).</a> Comptes rendus hebdomadaires des s&#233;ances de l'Acad&#233;mie des Sciences. S&#233;rie D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).</li><li>Segarra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+description+of+a+particular+Ostreid+herpesvirus.+1+genotype+associated+with+massive+mortality+outbreaks+of+Pacific+oysters,+Crassostrea+gigas,+in+France+in+2008.">Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008.</a> Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).</li><li>Suquet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+growth+and+reproduction+of+cryopreserved+larvae+from+a+marine+invertebrate,+the+Pacific+oyster+(Crassostrea+gigas).">Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-P&#225;ramo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobanking+of+aquatic+species.">Cryobanking of aquatic species.</a> Aquaculture. 472, 156-177 (2017).</li><li>Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+Balanus+amphitrite+nauplii.">Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii.</a> Cryobiology. 34, 131-140 (1997).</li><li>Oo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+nauplius+larvae+of+the+barnacle,+Balanus+amphitrite+Darwin.">Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin.</a> Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).</li><li>Lin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+study+on+gene+expression+of+cement+proteins+and+potential+adhesion-related+genes+of+a+membranous-based+barnacle+as+revealed+from+next-generation+sequencing+technology.">First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology.</a> Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).</li></ol>

Forfatterne har intet at erklære.

Barnacle kultur på Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige) har kørt over 20 år og har været anvendt til undersøgelser i mange forskellige forskningsområder. Over 30 videnskabelige papirer er blevet offentliggjort, har udnyttet de dyrkningsbaserede system i de seneste år, herunder undersøgelser i antibegroningsmidler13,22, hydrodynamik23, kemiske økologi24, klimaændringer16 , evolutionær biologi5og molekylærbiologi2.
For at undgå udvælgelsen af visse personer, der er mere tilpasset til laboratoriemiljø (enkeltpersoner, som ikke måske er repræsentativ for befolkningens vilde), anbefales det at indsamle en ny gydebestande fra feltet hvert år. Det er derudover også god praksis til at forynge kulturen årligt, da der er ca 50-80% af dødeligheden hos voksne under et normalt år. Men hvis målet er at producere indavlede linjer eller til at oprette undersøgelser af eksperimentel udvikling, kun laboratorium-opdrættet familier er skal anvendes.
En god tid at indsamle B. improvisus på paneler på Tjärnö Marine Research Laboratory er i juni-August, fordi på tidspunktet, der er et godt udbud af cyprid larver i havet. Kontrollere panelerne ugentligt at se Hvornår barnacle afvikling starter og manuelt fjerne andre afgjort arter end B. improvisus (f.eks.muslinger, sækdyr, bryozoans, hydroids, nemerteans/rørorme og andre barnacle arter) fra den paneler (f.eks.med en tandbørste). Omkring Tjärnö er der tre lavt vand barnacle arter til stede (B. improvisus, Semibalanus balanoidesog Balanus crenatus). B. improvisus er dog den dominerende fouler af glatte hårde overflader i løbet af juli – August. S. balanoides har sin afregningsperiode i tidlige forår og foretrækker primært naturlige substrater (f.eks., sten). B. crenatus kan forekomme ved lave numre på panelerne i løbet af sommeren.
Det er også muligt at starte nye voksen barnacle generationer fra kulturperler cyprids, som vil være afgørende, hvis bestemte linages med bestemte egenskaber er blevet etableret, eller i undersøgelser af eksperimentel udvikling. Den mest bekvemme måde at starte nye generationer af voksne er at udligne cyprids på termoplastisk paneler i laboratoriet. Disse paneler med nyligt udlignede cyprids kunne også anvendes, i eksperimentelle behandlinger eller for eksponering i feltet. I nødstilfælde, kan man også bruge voksne på kampesten fra et nærliggende sted (f.eks.Idefjorden ved Tjärnö Marine Research Laboratory) hvor B. improvisus er fælles. Disse allerede etablerede voksne behandles på samme måde som voksne på paneler, således at blive placeret i bakker og fodret via gennemstrømnings-system. Flow celler kan også bruges til at etablere paneler med rurer25. Disse er gennemstrømning kamre med plankton net i siderne, som cyprids ikke at nøjes, med paneler som den eneste løsning overflade for larverne.
Der er flere trin, som er kritiske for at konfigurere en langsigtet fungerende barnacle kultur herunder alle livsstadier. Metoderne til kultur B. improvisus er nok, for en stor dels vedkommende også gælder for andre marine hvirvelløse dyr med fritsvømmende, planktotrophic larver. Dyrkningsbaserede procedurer for nogle arter er allerede godt beskrevet (f.eks.for blåmuslinger og forskellige arter af østers)26, mens det for andre marine hvirvelløse dyr, der er kun et par eksempler på langsigtede kulturer der spænder over hele deres liv cyklus. En af de første vellykkede forsøg på at kultur rurer (B. amphitrite) blev udført af Rittschof et al. 15. langsigtede økonomiske og personlige ressourcer bør være på plads før man overvejer at oprette en barnacle dyrkning facilitet. Vedligeholdelse af denne form for år-omkring barnacle kultur kræver mindst én person arbejder halv tid. Der kan være nogle muligheder for den fremtidige automatisering af nogle trin i produktionslinje, især dyrkning af mikroalger27. Derudover for at lykkes, er det vigtigt at have adgang til store mængder af høj kvalitet havvand. Dyrkning af mikroalger, Artemia, og rurer indebærer ikke nogen særlige sikkerhedsprocedurer. Test af nogle antifouling stoffer eller giftige kemikalier skal dog kan særlige forholdsregler.
Panelerne var tjekket flere gange om ugen for forureninger. Havvandet bruges i kultur blev pumpet fra en 40 m dybde i Koster fjorden udenfor Tjärnö Marine Research Laboratory og var gået gennem to sandfiltre før indtastning af lab vandsystem. Hvis ingen filtrering af vandet havde gjort, ville der være meget mere forurening i kulturen. Det er vigtigt regelmæssigt rengøre paneler i kultur fra efterladenskaber og andre hvirvelløse dyr (f.eks.udloeber-bygning hydroids og aggressiv nemerteans) der ind i systemet gennem levering af havvand fra feltet. For eksempel, hvis ingen larver er produceret på trods af, at kulturen har været velnærede og ellers synes at være i god stand, opgave måtte være tilstedeværelsen af nemerteans, der synes at hæmme parring. Selvfølgelig, mange af de forurenende organismer i kultur på Tjärnö Marine Research Laboratory var specifikke for den svenske vestkyst, og andre typer af kontaminerende organismer vil være fremherskende og være mere af en udfordring i andre geografiske områder. På vestkysten af Sverige er det usædvanligt at finde kontaminering af andre barnacle arter på panelerne. Lejlighedsvis, etablering af S. balanoides er blevet fundet, men dette er en meget marginal problem (højst én S. balanoides forurenende for 10.000 B. improvisus prøver). Manglen på forurener arter var sandsynligvis afhængig af regimet til at etablere nye kulturer i løbet af sommeren, når larvaefrom B. improvisus var stærkt dominerende. Derudover var der også en klar berigelse af B. improvisus på panelerne da denne art er selektiv for glatte overflader13.
Det er vigtigt at fjerne døde voksne rurer. Hvis de tomme skaller er tilbage på paneler, kan de blive en læ både for Artemia nauplii og for forskellige forurenende arter. Derudover er det blevet bemærket, at døde personer indflydelse på trivsel i nabolandet personer, sandsynligvis med udgivelsen af giftige forbindelser under nedbrydning. En yderligere konsekvens af voksen dødelighed er, at nogle personer vil stå alene og for langt væk fra alle andre voksne at tillade parring (selvom rurer har den længste penis i dyrenes verden i forhold til dens størrelse)28. Disse individer vil overleve, men er ikke-produktive for larver. Men disse ensomme voksne individer kan forsigtigt fjernes uden at skade base-pladen og placeres vandret tæt på andre til parring. Barnacles kan også være parret ved at placere paneler med en voksen på hver men tæt nok, så krydsning kan forekomme. På denne måde, kan genetiske linjer være produceret14.
Det er afgørende at producere et foder af høj kvalitet og at fodre kulturer næsten hver dag. Selv et par dage uden mad kan resultere i en faldende frigivelse af larver. Tidligere undersøgelser af kost sammensætning har vist, at kiselalger er afgørende for vækst og overlevelse af barnacle nauplii. Flere diatom arter synes passende som foder, selv om små eller ensomme celler (mindre end 10 µm i diameter) kan være nødvendige for den nauplii indtagelse. Arterne, S. marinoi, C. simplexog T. pseudonana har alle vist sig for at være tilstrækkelig foder til B. improvisus nauplii, og nem at dyrke. Derudover er den foderkvalitet generelt højere for eksponentielt voksende alger. Det er også blevet rapporteret, at kiselalger er afgørende for oprettelse af produktive kulturer af B. amphitrite15. En teori om betydningen af kiselalger er at de har en unik fedtsyre profil og er særligt rige på meget flerumættede 20:5 fedtsyre29. Det har vist sig at visse fedtsyrer er vigtige for en vellykket udvikling af østers larver30.
I år, har der været ingen forekomst af skadelige sygdomme i barnacle kultur. I mange kommercielle hvirvelløse aquakulturer, som østers og muslinger, sygdomme er ret almindelige og kan være meget skadeligt. Skadelige virkninger af virus er også blevet rapporteret fra vilde populationer. De indfødte østers i Frankrig blev erstattet af den portugisiske østers Crassostrea angulata i 1925, men denne art blev udslettet ved en iridovirus omkring 197031. For nylig har der været massive dødelighed begivenheder i stillehavsøsters Crassostrea gigas i kulturer over hele verden, der synes at være forbundet med ostreid herpesvirus 132. Ingen rapporter om patogener, bakterier eller virus på barnacles er blevet offentliggjort hidtil. Men i det igangværende genom-projektet på B. improvisus, virus sekvenser blev fundet (Alm Rosenblad et al., upublicerede data), men med nogen åbenlys forbindelse til symptomer på sygdomme. Blandinger af antibiotika har tidligere været anvendt kulturer at minimere risikoen for bakterielle infektioner; men denne fremgangsmåde er i øjeblikket opgivet og hidtil har det ikke forårsaget forurening problemer.
Hvis havvand er opvarmet (som beskrevet ovenfor), kan overophedning være den mest alvorlige risiko i kultur produktionslinje. Det er naturligvis vanskeligt at beskytte mod overophedning, selvom sensorer og passende alarmsystemer kan være brugt (f.eks.at sende e-mail eller SMS-beskeder til ansvarlige personer). Forekomster af denne slags i fortiden har resulteret i betydelige drabet af voksne i kulturen. Dette kan selvfølgelig være ødelæggende og ødelægge langsigtede investeringer i tid og penge. Dette ville især være katastrofale hvis genetiske indavlede har været etableret. For at sikre levetid af disse linjer og sikre dem mod hændeligt tab, ville det være ønskeligt at udvikle en kryopræservering metodologi til rurer. Det er blevet rapporteret, at larver fra den stillehavsøsters kan være frosset ned og genoplivet med delvis succes33. Cryobanking har også været et værdifuldt redskab til at bevare de genetiske ressourcer i en lang række arter34. Selv nauplii fra B. amphitrite er rapporteret at overleve frysning35, og det konstateredes, at 20% af de personer, frosset ned med succes forvandlet til cyprids36. Imidlertid anvende frysning for den langsigtede bæredygtighed af kulturer er hidtil ikke blevet vedtaget, men det ville faktisk være behov for vedligeholdelse af valgte linjer; Dette ville være et vigtigt skridt til at fast etablering af B. improvisus til en potent marine modelsystem.
Her, blev en protokol, der præsenteret for dissektion af forskellige væv fra voksne af B. improvisus (dvs., cirri, soma og mantel). Det skal dog understreges, at andre væv også kan udvindes. For eksempel er bløddelsvæv mellem ydre og indre kappen af membranøs-base arter Tetraclita japonica formosana omhyggeligt isoleret og bruges til en RNA udvinding og RNA-seq analyse af gen expression37. Den skitserede optimeret udvinding protokollen beskrevet her giver tilstrækkelige mængder af høj kvalitet RNA til sekvensering fra en minimal mængde af starter materiale. Første minimerer samling af enkelte larver direkte til homogenisering rør tab under overførslen fra et rør til et andet. Desuden afprøves blandt de forskellige metoder, homogenisering med keramiske perler viste sig for at være den mest effektive med hensyn til RNA afkast og integritet, i forhold til sonikering eller pistil homogenisering. Når du planlægger for genekspression eller genomforskning eksperimenter, har man til at huske udfordringen af høj genetisk variation i rurer, mindst for B. improvisus. Barnacle har en genetisk diversitet i størrelsesordenen 3-5%, selv i kodende regioner (Alm Rosenblad et al., upublicerede data). Dette, selvfølgelig, sætter specifikke krav om udformningen af primere for qPCR analyse, hvor mere bevaret regioner bør identificeres og bruges som skabeloner til primere for at få konsekvent udtryk resultater betweenbatches. Bevarede regioner for target gener, som aquaporins og Na +/ K + ATPases, kan identificeres ved at studere sekvens variation af disse gener i RNA-seq data indhentet fra populationer af cyprids der indeholder hundredvis af enkeltpersoner. DNA vil udtages prøver til en analyse af genom. Men, at opnå høj kvalitet DNA fra B. improvisus kan være udfordrende21.
Afslutningsvis, etablerede barnacle kultur har vist sig for at være medvirkende til forskellige slags eksperimentelle undersøgelser. Især all-året-rundt larve produktionen tillader os at udføre eksperimenter uden at være begrænset til de naturligt forekommende gydeperioden ( B. improvisus, er det om sommeren). Fremkomne larver kan bruges til at udføre en lang række eksperimentelle undersøgelser, herunder afregning assays, opførsel assays, udtryk undersøgelser af specifikke gener, samt genome-wide transkriptom undersøgelser.

Barnacles er marine krebsdyr med en siddende voksen og fritsvømmende, planktoniske larver. De fleste af de 1.200 arter af rurer bebor grundt vand og mange udsættes ofte for lavt saltindhold. Én art, den bay barnacle Balanus (Amphibalanus) improviserer (B. improvisus), kan tåle næsten ferskvand og Charles Darwin beskrev denne art fra en lille bæk i mundingen af Rio de la Plata i Uruguay1. Ekstrem tolerance tolow saltindhold gør B. improvisus en særlig relevant model for studier af osmoregulatory mekanismer2,3. Denne barnacle foretrækker brakvand betingelser, men er i stand til at leve i farvande med saltholdigheder fra omkring 1,6 psu så højt som 40 psu4. Det er den eneste barnacle arter fundet i brakvand Østersøen. B. improvisus menes at stamme fra østkysten af det amerikanske kontinent, men i dag er fundet over hele verden på grund af spredning af shipping5. Det er en stor begroning organisme og er almindeligt forekommende på sten, moler og båd skrog, og er derfor af almen interesse for at forstå mekanismerne af biofouling på konstruktioner i marine-og brakvand6,7.
I lighed med de fleste andre rurer, B. improvisus er tvekønnede med krydsning; reproduktion sker gennem parring mellem tilstødende enkeltpersoner ved hjælp af et aflangt penis og indre befrugtning. Den reproduktive periode er hovedsageligt fra maj til September. B. improvisus har syv pelagiske larve stadier (seks nauplii efterfulgt af en cyprid fase8). De befrugtede æg luger i en nauplius larve, som er fritsvømmende og feeds i vandsøjlen for op til flere uger før molting i en ikke-fodring cyprid larve. Cyprid bruger flere stikord til at finde et passende sted at bosætte sig og derefter undergår metamorfose i en siddende juvenile barnacle9. Arten kan blive kulturperler i laboratoriet og har en levetid på 1-2 år i havet (2 – 3 år i laboratoriet kultur). I gennemsnit, B. improvisus vokser til 10 mm i diameter (med et maksimum på omkring 20 mm) og når en maksimal højde på ca. 6 mm (selv om det kan vokse højere overfyldt betingelser). Arterne kan være identificeret ved dens glat kalkrige selv shell (hvid eller gråligt), radialt mønstrede kalkrige bunden af shell plade, og formen af tergal plader1,10.
Barnacle B. improvisus har flere fordelagtige funktioner som en model for studier af osmoregulering, med fokus på molekylære og fysiologiske mekanismer samt økologiske interaktioner og evolutionære konsekvenser. Det er også almindeligt anvendt som en model for undersøgelser af afregning biologi, navnlig i forbindelse med antifouling forskning og mekanismer involveret7,11,12,13. Men naturlig årstidens gydning udbytter en uforudsigelig forsyning af cyprid larver for undersøgelser. Evnen til at kultur denne barnacle gennem hele sin livscyklus hele året er derfor et stort aktiv aktivere forskellige typer af molekylære og Mekanistiske undersøgelser. Derudover sin tilstedeværelse i marine/brakvand på verdensplan giver mulighed for en kombination af felt og eksperimentelle undersøgelser. Kontrolleret avl kan også producere familier af kendte stamtavler for langsigtet dyrkningsbaserede14, og en generationstid af et par måneder kan tillade langsigtede eksperimentel udvikling. Der findes også et udkast til genom og flere transcriptomes, og disse midler er blevet anvendt til kloning af flere gener (fx, gener af betydning i osmoregulering)2,3.
Formålet med denne protokol er at beskrive, hvordan at etablere og vedligeholde en kultur af barnacle B. improvisus hele året for at udføre gen expression undersøgelser på voksne eller larver af denne skadegører. Rittschof et al. 15 kort beskrevet en metode til dyrkning rurer fra frigivelsen af nauplii til bilæggelse af cyprids for arter Balanus amphitrite. Protokollen er blevet tilpasset for hele året rundt dyrkning af B. improvisus ved Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige), og en detaljeret beskrivelse af alle trin i produktionslinjen er skitseret, herunder produktion og opdræt af barnacle larver, samt administration af foder til voksne og larver. En oversigt over den komplette procedure, se figur 1. Brugen af de dyrkningsbaserede system er eksemplificeret med nogle fælles eksperimentelle opstillinger og illustreret i funktionel genomforskning undersøgelser af Na+/K+ ATPase og aquaporins, belyse deres mulige funktioner i osmoregulering2, 3. Det er sommetider nødvendigt at undersøge genekspression i specifikke væv, og nogle af grundlæggende af barnacle dissektion vil blive dækket. Med et godt udbud af høj kvalitet havvand bør dyrkning af barnacle B. improvisusog potentielt mange andre arter, i marine laboratorier i hele verden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1244px;" width="1243">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels</td>
			<td style="width:364px;">Plastic produkter, Bromma, Sweden</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:385px;">transparent glas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-L PET bottle</td>
			<td style="width:364px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artemia</td>
			<td>INVE Aquaculture, Belgium</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>We have tested different companies; this is really the best one</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1077/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1085/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millipore cartridge filter system</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cartridge with a nominal pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;">cartridge CWSS01S03</td>
			<td>High capacity for large volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polycarbonate bottle</td>
			<td style="width:364px;">Nalgene</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA later</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">76106</td>
			<td>&#160;Fixation solution to preserve RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:364px;">Invitrogen/Thermofisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>DNAse kit to remove DNA from prepared RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708880</td>
			<td>Dye for QPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy minikit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction of adults or many cyprids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes</td>
			<td style="width:364px;">Precellys</td>
			<td style="width:153px;">KT03961-1-003.2</td>
			<td>Ceramic beads for homogenisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">74004</td>
			<td>RNA extraction of few cyprids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression

Barnacles er marine krebsdyr med en siddende voksen og fritsvømmende, planktoniske larver. Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er især relevant som en model for studier af osmoregulatory mekanismer på grund af sin ekstreme tolerance til lavt saltindhold. Det er også almindeligt anvendt som en model af afregning biologi, navnlig i forbindelse med antifouling forskning. Men naturlig årstidens gydning udbytter en uforudsigelig forsyning af cyprid larver for undersøgelser. En protokol for alle året rundt dyrkning af B. improvisus er blevet udviklet og en detaljeret beskrivelse af alle trin i produktionslinjen er skitseret (dvs., etablering af voksen kulturer på paneler, indsamling og opdræt af Barnacle larver, og administrationen af foder til voksne og larver). Beskrivelsen også giver vejledning i fejlfinding og diskuterer kritiske parametre (f.eks.fjernelse af forurening, produktion af høj kvalitet foder, den nødvendige arbejdskraft og betydningen af høj kvalitet havvand). Hvert enkelt parti fra dyrkningsbaserede systemet maksimalt udbytter ca 12.000 nauplii og kan levere fire partier i en uge, så op til næsten 50.000 larver pr. uge kan produceres. Metoden til kultur B. improvisus er sandsynligvis i vid udstrækning også gælder for andre marine hvirvelløse dyr med gratis swimminglarvae. Protokoller er præsenteret for dissektion af forskellige væv fra voksne samt produktion af høj kvalitet RNA til studier af genekspression. Det er også beskrevet hvordan kulturperler voksne og opdrættede cyprids kan udnyttes i en bred vifte af eksperimentelle design for behandlingen af genekspression i forhold til eksterne faktorer. Brugen af dyrkede Langhalsearter i genekspression er illustreret med undersøgelser af mulige osmoregulatory roller af Na+/K+ ATPase og aquaporins.

Larverne produceres pr. uge med den beskrevne procedure for dyrkning af voksen rurer af B. improvisus, op til fire partier af nauplius. Det ville være muligt at indsamle nauplius larver næsten hver aften, men det kræver flere mennesker og infrastruktur (med mange rurer i gydebestande, en kultur vil frigive larver kontinuerligt). En yderligere begrænsende faktor for larver produktion synes at være tilgængeligheden af foder af høj kvalitet, især hvad angår diatom Skeletonema. Maksimalt, består hvert parti fra dyrkningsbaserede systemet af omkring 12.000 nauplii, så op til 50.000 nauplii pr. uge kan være kulturperler. Men, nogle uger der kan være op til ti gange færre larverne produceres. En enkelt voksen kan producere op til 7.000 larver pr. dag14, hvilket betyder, at 1-2 voksne frigiver larver for hvert parti. Inden for en uge, vil omkring 70 – 90% af de indsamlede nauplii udvikle sig til cyprids (giver ca 30.000 cyprids om ugen, maksimalt), der kan bruges til udligning assays og molekylære undersøgelser.
Det skal understreges, at der er variationer i cyprid funktioner mellem partier, og der er generelt større variationer mellem partier end inden for batchnumre. For eksempel, varierer bilægge succes i forliget assays mellem 30 og 70% for forskellige partier. Sandsynligvis, dette er forårsaget af den individuelle genetiske variation mellem de specifikke par af voksne frigive larver perioder forskellige stikprøver. Det anbefales naturligvis at gentagne eksperimenter (biologiske replikater) bør omfatte cyprids fra en række partier, hvis mere generelle udtalelser om resultaterne skal foretages. Batch til batch variationer stiller krav på det eksperimentelle design, hvor ordentlig kontrol og normalizations i gen expression undersøgelser bør anvendes. Men selv efter flere statistiske normalisering procedurer er blevet gennemført, betydeligt reducere mellem batch variation, nogle effekter af partiet er normalt stadig synlige (ikke-offentliggjorte data).
Efter den angivne protokol, er det muligt at få i gennemsnit 500 ng af høj kvalitet RNA fra så lidt som 20 cyprids, uanset fase af barnacle afvikling (tabel 1). Kvaliteten af RNA er normalt måles som forholdet mellem de 18S og 28S toppe (den forventede position af de to toppe er angivet i figur 4). Dog rurer og mange andre leddyr, 28S rRNA bryder ned, når det opvarmes (som en del af den analysemetode, der) og trækker sammen med 18S top20. Dette er hvorfor der er i princippet én enkelt rRNA peak i denne type analyse for rurer. Det fremgår af denne test (figur 4) at en homogenisering af keramiske perler giver RNA med den højeste integritet og derfor er den foretrukne metode. RNA er tilstrækkelig mængde og kvalitet til at skabe høj kvalitet sekventering biblioteker til sekvensering, hvilket resulterer i et gennemsnit på 70 millioner læser per prøve (antallet af læser, naturligvis, afhænger af niveauet for multiplexing under Sekventeringen). RNA er også tilstrækkeligt, cDNA syntese og qPCR udtryk analyse af et stort antal gener.
Figur 5 viser resultatet fra qPCR analyser af aquaporins og af Na+/K+ ATPase (NAK1) splejse varianter, hvor udtrykket ændringer blev undersøgt som svar på ændringer i miljøet stikord2,3. En sammenligning af den relative udtryk af langt og korte splejse varianter af NAK1 viser en dobbelt stigning for de lange NAK1 mRNA i lavt saltindhold i forbindelse med den korte NAK (figur 5A). Dataene viser således, at alternativ splicing gør den lange form fremherskende lavt saltindhold betingelser. For aquaporins er det tydeligt, at de to vand-transport paralogs AQP1 og AQP2 vise differential udtryk (figur 5B). Især i kappen væv er det klart, at AQP1 er væsentligt nedreguleret på lavere saltholdigheder, som ikke er set i AQP2. I stedet viser AQP2 et let øget udtryk ved lavere saltholdigheder, men i soma. Disse resultater giver en base for efterforskning af de funktionelle roller de forskellige B. improvisus ion transportvirksomheder og aquaporins i barnacle osmoregulering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg"> Figur 1 : Oversigt over hele dyrkning procedure og RNA udvinding for gen expression undersøgelser på voksne. For at indlede en ny kultur, er paneler knyttet til en ramme og indsat i havet på 1-3 m dybde. Efter flere uger anbringes paneler med voksne/unge lodret i stativer i bakker i laboratoriet. Hver bakke besidder omkring 40 paneler med voksne. Med omtrent 100 voksne pr. panel, i samlede ≈ er 4.000 voksne individer kulturperler pr. bakke. De voksne rurer fodres med Artemia og kan holdes året-rundt. Nauplius larver er indsamlet flere gange om ugen fra bakker via en filtrering gennem en sigte. De indsamlede nauplii er overført til spande holdt ved 26 ° C i et vandbad og fodret med mikroalger. Nauplii opdrættes, indtil de molt ind i ikke-fodring cyprids, som er indsamlet af filtrering. Nye paneler kan etableres i laboratoriet ved afregningen af cyprids på paneler, enten for at give nye paneler for år-omkring kultur eller skal anvendes til specifikke eksperimentelle opstillinger med ændrede ydre forhold. RNA er derefter udvundet fra unge/voksne i slutningen af forsøget eller på bestemte tidspunkter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg"> Figur 2 : Billeder af nogle vigtige trin i proceduren dyrkningsbaserede. (A) dette billede viser rammer med paneler til at indsamle nye befolkninger fra feltet. (B) dette billede viser paneler med voksen rurer af B. improvisus i stativer, der er placeret i bakker. Panelerne er placeret ca. 2 cm fra hinanden. (C) dette billede viser bakker med langhalsen paneler og fodring tanken til venstre. Fra hver bakke er der en outlet, hvor sigterne placeres for indsamling af nauplius larver. (D) dette billede viser produktionen af Artemia foder til de voksne rurer. (E) dette billede viser opdræt af nauplii i spande placeret i vandbad indstillet til 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg"> Figur 3 : Beskrivelse af trinene indledende dissektion af voksen rurer: fjernelse af kroppen fra sin råtanken. (A) Grab en af opercular pladerne ved at indsætte pincet forsigtigt gennem blænde. Træk forsigtigt for at fjerne pladen og udsætte dyret. (B) trække dyret ved at snuppe soma del lige under cirri. (C) dette panel viser den samlede anatomi af agern rurer. Kappe og potentielt befrugtede æg (i æggestokkene) ophold i shell hulrum, når kroppen er trukket ud. En note på barnacle anatomi (for en mere dybdegående konto, se Anderson)9: væg plader af en barnacle skråner indad, og de udgør tilsammen en vulkan-lignende kegle. En åbning, blænden, er omfattet af de to opercular plader, der udgør en dør, eller laag, at lukke blænde. Acorn rurer har generelt en kalkholdig basal plade, der er limet fast til undergrundens; Men, nogle arter af rurer mangler denne kalkholdige plade (f.eks. S. balanoides). Barnacles udskiller exoskeleton fra mørkt pigmenteret kappen (skjoldet). Den ydre overflade af dobbelt-lags kappen er forkalket for at blive stift, mens den indvendige overflade af kappen ikke er forkalket og derfor er fleksibel. Inde i aperture er cirri til stede i en tilbagetrukken stilling. Disse er de thorax vedhæng, som rurer bruger til suspension fodring. Æggestokkene er placeret tæt på bunden af barnacle, mens testiklerne ligger i soma. Dette tal er vedtaget fra Panova et al. 21 og er blevet offentliggjort med tilladelse fra Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg"> Figur 4 : Bestemmelse af rRNA integritet af kapillar gelelektroforese. RNA er udarbejdet af to forskellige homogenisering metoder: (A) ultralydbehandling og (B) keramiske perler. Enheden på y-aksen, FU, står for fluorescens enheder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg"> Figur 5 : Genekspression resultater fra to forskellige undersøgelser af gener, der er vigtige for osmoregulering i B. improvisus. (A) dette panel viser det differentierede udtryk som målt ved qPCR splice varianter af Na+/K+ ATPase NAK1 svar på forskellige saltholdigheder og pCO2 niveauer3. I den lave saltholdighed behandling, udtryk for den lange isoform (NAK1-L) er steget i forhold til kort (ANOVA, P < 0,001). (B) dette panel viser udtryk for aquaporins i voksne af B. improvisus under deres eksponering for forskellige saltholdigheder2. qPCR blev brugt til at bestemme aquaporin udtryk niveauer i forhold til aktin. Voksne individer blev inkuberet ved 3 forskellige saltholdigheder (3, 20 og 33 PSU) i 14 dage. Forberedelsen RNA blev soma, cirri og kappe af voksne adskilt. I begge tal angiver fejllinjer standardafvigelsen. Den ** og *** angiver niveauet af betydning (ANOVA), 0,01 og 0,001, henholdsvis. Disse tal er blevet ændret fra Lind et al. 2 , 3. begge tal er offentliggjort med tilladelse fra PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Afregning fase</td>
			<td>Samlede antal RNA (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fri svømning</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Udforskning: Luk søgning</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vedlagte cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nyligt forvandlede juvenile</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: udbytter af RNA. Denne tabel viser de RNA antal ekstraheres med en RNA forberedelse kit fra puljer af 20 cyprid individer indsamlet på forskellige stadier under udligningsprocessen.

Watch this Scientific Journal Video about The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression at JoVE.com

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er en model til at studere osmoregulering og bundmaling. Men naturlig årstidens gydning udbytter en uforudsigelig forsyning af cyprid larver. Her, er en protokol for alle året rundt dyrkning af B. improvisus beskrevet, herunder produktion af larver. Brugen af dyrkede Langhalsearter i gen expression undersøgelser er illustreret.

Barnacle Balanus improvisus som en Marine Model - dyrkning og genekspression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Research

JoVE Journal

Environment

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Forbigående genekspression i Tobacco hjælp Gibson forsamling og Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Unraveling de usete Spillere i Ocean - A Field Guide til Water Chemistry and Marine Mikrobiologi

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

En fisk-fodring Laboratory bioassay i vurdering af den Antipredatory aktivitet af sekundære metabolitter fra væv af marine organismer

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VacuSIP, en forbedret Inex Metode til<em&gt; In Situ</em&gt; Måle partikler og opløst Forbindelser Bearbejdet af aktiv affjedring Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

Udvikling af nye metoder til kvantificering af fisk tæthed ved hjælp af undersøiske Stereo-video værktøjer

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Methods for Image-based Surveys of Benthic Macroinvertebrates and Their Habitat Exemplified by the Drop Camera Survey for the Atlantic Sea Scallop

Metoder til Image-baserede undersøgelser af bentiske Macroinvertebrates og deres levesteder, eksemplificeret ved slip kamera undersøgelse til Atlanten havet kammusling

Underwater imaging has long been used in the field of marine ecology but decreasing costs of high-resolution cameras and data storage have made the ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridisering teknikker til Paraffin-Embedded voksen koraller prøver

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Enkelte dyrkning af Tigriopus vandlopper og kvantitativ analyse af deres Mate-bevogtning adfærd

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster (Nephrops norvegicus)

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster Nephrops norvegicus

Langsigtet Video sporing af Cohoused vanddyr: et casestudie af den daglige bevægeapparatet aktivitet af jomfruhummer (Nephrops norvegicus)

We present a protocol related to a video-tracking technique based on the background subtraction and image thresholding that makes it possible to ...

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Microfocus X-ray CT microCT Imaging of Actinia equina Cnidaria, Harmothoe sp. Annelida, and Xenoturbella japonica Xenacoelomorpha

MicroFocus X-ray CT (microCT) Imaging af Actinia equina (CNIDARIA), Harmothoe Sp. (Annelida), og xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...