Name: the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00
Duration: 7 min 47 s
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Cette recherche a été financée par grant 2017-04559 par le Conseil de recherche suédois (VR) et le projet pris en charge front de mer de l’UE à Anders Blomberg. En particulier, la création de la facilité de culture, au cours des années, bénéficie de subventions à par R. Jonsson auprès des agences de financement suivantes : SSF (Fondation suédoise pour la recherche stratégique) grâce au programme de sciences de la mer et la technologie et MISTRA grâce au programme de peinture Marine. Kent Berntsson a joué un rôle dans les premières phases de mise en place de la culturingfacility. Financement supplémentaire pour établir la facilité de culture est venu du Centre pour la biologie Marine de l’évolution (www.cemeb.science.gu.se), qui est financée par une subvention de Linné du suédois recherche conseils FORMAS et VR.

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Les auteurs n’ont rien à déclarer.

La culture de barnacle au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (Suède) a fonctionné plus de 20 ans et a été utilisée pour des études dans de nombreux domaines de recherche différents. Plus de 30 articles scientifiques ont été publiés qui ont utilisé le système de culture au cours des dernières années, y compris les études en antifouling13,22, hydrodynamique,23, écologie chimique24, le changement climatique16 , Biologie Evolutive5et2de la biologie moléculaire.
Pour éviter la sélection de certaines personnes qui sont plus adaptées à l’environnement de laboratoire (individus qui pourrait ne pas être représentatif de la population sauvage), il est recommandé de recueillir un nouveau stock de géniteurs du champ chaque année. En outre, il est également conseillé de rajeunir la culture chaque année, puisqu’il n’y a à peu près 50-80 % de la mortalité chez les adultes au cours d’une année normale. Toutefois, si le but est de produire des lignées autofécondées ou de mettre en place des études de l’évolution expérimentale, seules les familles élevées en laboratoire doivent être utilisées.
Un bon moment pour recueillir des b. improvisus sur les panneaux au laboratoire de recherche Marine Tjärnö est en juin – août parce qu’à ce moment-là, il y a une bonne provision d’une larve cypris la mer. Vérifiez les panneaux chaque semaine pour voir quand la colonie barnacle commence et supprimer manuellement des autres se sont installés d’espèces b. improvisus (p. ex., les moules, tuniciers, bryozoaires, hydres, némertiens/vers tubicoles et autres espèces de barnacle) de la panneaux (par exemple, avec une brosse à dents). Autour de Tjärnö, il y a trois eaux peu profondes barnacle espèces présentes (b. improvisus, Semibalanus balanoideset Balanus crenatus). Cependant, b. improvisus est le principal fouler de surfaces dures lisses en juillet – août. S. balanoides a sa période de règlement au début du printemps et préfère principalement sur les substrats naturels (p. ex., pierres). B. crenatus peut survenir à faibles effectifs sur les panneaux au cours de l’été.
Il est également possible de démarrer de nouvelles générations balane adulte de cypris cultivées, ce qui serait essentiel si certains Chehalis avec des traits spécifiques ont été établies, ou dans l’étude de l’évolution expérimentale. Pour démarrer de nouvelles générations d’adultes, la plus commode consiste à régler cypris sur panneaux thermoplastiques en laboratoire. Ces panneaux avec cypris nouvellement établis pourrait également être utilisé dans les traitements expérimentaux ou pour exposition sur le terrain. En cas d’urgence, on peut aussi utiliser des adultes sur les rochers d’un site à proximité (par exemple, Idefjorden dans le cas du laboratoire de recherche Marine de Tjärnö) où b. improvisus est fréquente. Ces adultes déjà établies sont traités de la même manière que les adultes sur les panneaux, donc être placés dans des plateaux et alimentés par l’intermédiaire de système. Cellules d’écoulement permet également de créer des panneaux avec balanes25. Voici les accréditifs chambres avec filet sur les côtés où les cypris ne vous contentez pas, avec des panneaux sous la surface du seul établissement pour les larves à plancton.
Il y a plusieurs étapes qui sont essentielles pour mettre en place une culture barnacle fonctionnement à long terme, y compris toutes les étapes de la vie. Les méthodes utilisées pour la culture b. improvisus sont probablement, dans une large mesure, également applicable à d’autres invertébrés marins pélagiques, larves planctoniques. Procédures de culture de certaines espèces sont déjà bien décrites (par exemple, pour les différentes espèces d’huîtres et de moules bleues)26, tandis que pour d’autres invertébrés marins, il y a seulement quelques exemples des cultures à long terme couvrant toute leur vie cycle. Une des premières tentatives réussies de balanes (B. amphitrite) de la culture a été réalisée par Rittschof et al. 15. les ressources financières et personnelles à long terme devraient être en place avant d’envisager la mise en place d’une balane facilité de culture. L’entretien de ce type d’année-autour de barnacle culture nécessite au moins une personne travail mi-temps. Il peut y avoir quelque potentiel pour l’automatisation future de certaines étapes de la chaîne de production, principalement la culture de micro-algues27. En outre, pour réussir, il est essentiel d’avoir accès à de grandes quantités d’eau de mer de haute qualité. La culture de microalgues, Artemia et balanes n’implique pas des procédures particulières de sécurité. Cependant, les essais de certains antifouling substances ou produits chimiques toxiques peuvent devoir des précautions spéciales.
Les panneaux ont été vérifiés plusieurs fois par semaine pour des contaminations. L’eau de mer utilisée dans la culture a été pompé vers le haut d’une profondeur de 40 m dans le Fjord de Koster en dehors du laboratoire de recherche Marine de Tjärnö et était passé à travers deux filtres à sable avant d’entrer dans le circuit d’eau de laboratoire. Si aucun filtrage de l’eau n’avait été faite, il y aurait beaucoup plus de contamination dans la culture. Il est essentiel de nettoyer régulièrement les panneaux dans la culture de détritus et d’autres invertébrés (par exemple, renforcement des stolons hydroïdes et prédateurs némertiens) qui entrent dans le système par le biais de l’approvisionnement en eau de mer sur le terrain. Par exemple, si aucune larve n’est produites malgré le fait que la culture a été bien nourris et autrement semble être en bon état, le problème pourrait être la présence des némertiens qui semblent inhiber l’accouplement. Naturellement, bon nombre des organismes contaminants dans la culture au laboratoire de recherche Marine Tjärnö étaient spécifiques à la côte ouest suédoise, et autres types de contamination des organismes seront répandues et être plus difficile à d’autres endroits. Sur la côte ouest de la Suède, il est rare de trouver de la contamination par d’autres espèces de balanes sur les panneaux. Parfois, la mise en place de S. balanoides a été trouvé, mais il s’agit d’un problème très marginal (tout au plus, un art. balanoides contaminant pour 10 000 échantillons de b. improvisus ). L’absence de contamination des espèces dépendait probablement le régime pour établir de nouvelles cultures durant l’été, quand les larvaefrom b. improvisus ont été très dominante. En outre, il y avait aussi un enrichissement clair de b. improvisus sur les panneaux puisque cette espèce est sélective pour les surfaces lisses,13.
Il est indispensable d’éliminer les balanes adultes morts. Si les coquilles vides sont laissées sur les panneaux, ils peuvent devenir un refuge pour nauplies d’artémias et diverses espèces de contaminants. En outre, il a été remarqué que les individus morts influent sur le bien-être des individus, probablement avec la libération de composés toxiques lors de la décomposition de voisins. Une autre conséquence de la mortalité adulte est que certaines personnes seront laissés seul et loin de tout autres adultes afin de permettre l’accouplement (même si les balanes ont le pénis plus longs dans le monde animal par rapport à sa taille)28. Ces personnes vont survivre mais sont non productives pour les larves. Toutefois, ces individus adultes solitaires doucement peuvent être enlevés sans endommager la plaque de base et être placés horizontalement à proximité d’autres pour permettre l’accouplement. Balanes peuvent également être utilisées en plaçant des panneaux avec un adulte sur chacun, mais assez proche pour que la fécondation croisée peut survenir. De cette façon, les lignées génétiques peuvent être produite14.
Il est essentiel pour produire un flux de haute qualité et nourrir des cultures presque tous les jours. Encore quelques jours sans nourriture peuvent entraîner une libération décroissante des larves. Des essais antérieurs de la composition du régime alimentaire ont montré que les diatomées sont essentielles pour la croissance et la survie des nauplius de barnacle. Plusieurs espèces de diatomées semblent suffisantes comme se nourrir, bien que les cellules petites ou solitaires (moins de 10 µm de diamètre) peuvent être nécessaires pour l’ingestion de la nauplius. L’espèce S. marinoi, c. simplexet T. pseudonana ont tous s’est avérée l’alimentation adéquate pour nauplies de b. improvisus , ainsi que facile à cultiver. En outre, la qualité fourragère est généralement plus élevée en croissance exponentielle des algues. Il a également été signalé que les diatomées sont essentielles pour établir les cultures productives d’amphitrite B.15. Une théorie de l’importance des diatomées est qu’ils ont un profil d’acide gras unique et sont particulièrement riches en acides gras très polyinsaturés 20:529. Il a été démontré que certains acides gras sont importants pour le succès du développement des larves d’oyster30.
Au cours des années, il n’y a eu aucune incidence de maladies nuisibles dans la culture de barnacle. Dans beaucoup de commercial aquaculture d’invertébrés, comme les huîtres et les moules, les maladies sont assez communs et peuvent être très nocifs. Les effets néfastes des virus ont également des populations sauvages. L’huître indigène en France a été remplacé par l’huître portugaise Crassostrea angulata en 1925, mais cette espèce a été anéantie par un iridovirus autour de 1970,31. Plus récemment, il y a eu épisodes de mortalité massive dans l’huître Crassostrea gigas dans les cultures dans le monde entier, ce qui semble être associée à l' herpèsvirus de type 1 d’ostreid32. Aucun rapport sur les agents pathogènes, bactéries ou les virus sur les bernaches n’ont été publiés jusqu'à présent. Cependant, ont observe des séquences du virus dans le génome-projet en cours sur improvisus b., (Alm Rosenblad et al., données non publiées) mais sans aucun lien apparent aux symptômes des maladies. Mélanges d’antibiotiques ont précédemment été appliqués aux cultures afin de minimiser le risque d’infections bactériennes ; Toutefois, cette procédure est actuellement abandonnée et jusqu’ici, cela n’a pas causé des problèmes de contamination.
Si l’eau de mer est chauffée (comme décrit ci-dessus), la surchauffe peut être le risque le plus grave dans la ligne de production de la culture. Bien sûr, il est difficile de protéger contre la surchauffe, même si les capteurs et systèmes d’alerte appropriés peuvent être utilisés (par exemple, envoyer des messages e-mail ou texte à personnes responsables). L’incidence de ce type dans le passé ont entraîné la mort importante d’adultes dans la culture. Ceci peut, bien sûr, être dévastateur et ruiner les investissements à long terme de temps et d’argent. En particulier, ce serait catastrophique si les lignées génétiques ont été établies. Pour assurer la longévité de ces lignes et fixez-les à perte accidentelle, il serait souhaitable d’élaborer une méthodologie de cryoconservation des balanes. Il a été signalé que les larves de l’huître du Pacifique peuvent être congelés vers le bas et relancés avec succès partiel33. Cryobanking a également été un outil précieux pour préserver les ressources génétiques d’un large éventail d’espèces34. Même les nauplii de B. amphitrite sont censés survivre congélation35, et il a été constaté que 20 % des individus congelés en bas avec succès métamorphosé en cypris36. Toutefois, appliquant le gel pour assurer la durabilité à long terme des cultures n’a jusqu'à présent pas été adoptée, mais cela serait en effet nécessaire pour l’entretien des lignes sélectionnées ; ce serait une étape essentielle pour établir fermement b. improvisus dans un modelsystem puissant de marine.
Ici, un protocole a été présenté pour la dissection des tissus différents des adultes b. improvisus (c.-à-d., cirres, soma et manteau). Toutefois, il convient de souligner que les autres tissus peuvent également être extraits. Par exemple, les tissus mous entre le manteau extérieur et intérieur de l’espèce membraneux-base Tetraclita japonica formosana a été soigneusement isolé et utilisé pour une extraction de l’ARN et l’analyse de la RNA-seq de gene expression37. Le protocole d’extraction optimisée décrit décrit ici fournit des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour le séquençage d’une quantité minimale de matière première. Tout d’abord, la collection de larves individuels directement dans les tubes d’homogénéisation minimise toute perte lors du transfert d’un tube à l’autre. En outre, parmi les différentes méthodes testées, l’homogénéisation avec perles en céramique s’est avérés pour être le rendement le plus efficace en termes de RNA et intégrité, par rapport à l’homogénéisation de sonication ou un pilon. Lors de la planification pour l’expression des gènes ou des expériences de génomique, il faut garder à l’esprit le défi de la variation génétique élevé de balanes, au moins pour b. improvisus. Barnacle présente une diversité génétique dans la gamme de 3 à 5 %, même dans les régions (Alm Rosenblad et al., données inédites) de codage. Ceci, bien sûr, met les demandes spécifiques sur la conception d’amorces pour l’analyse de qPCR, où plus conservé les régions devraient être identifiées et utilisées comme modèles pour les amorces afin d’obtenir l’expression cohérente des résultats betweenbatches. Des régions conservées de gènes cibles, comme les aquaporines et Na + / K + ATPases, peuvent être identifiés par l’étude de la variabilité de la séquence de ces gènes dans RNA-seq données obtenues à partir des populations de cypris contenant des centaines de personnes. Pour une analyse du génome, ADN est échantillonné. Cependant, obtenir l’ADN de haute qualité de b. improvisus peut être difficile de21.
En conclusion, la culture établie barnacle s’est avéré pour être instrumental dans différents types d’études expérimentales. En particulier, la production de larves tous-an-environ nous permet de réaliser des expériences sans être limité à la période de frai naturelle (pour b. improvisus, c’est au cours de l’été). Les larves obtenues peuvent être utilisés pour effectuer un large ensemble d’études expérimentales, y compris les essais de colonisation, tests de comportement, études sur l’expression des gènes spécifiques, ainsi que génome transcriptome études.

Balanes sont des crustacés marins accompagné d’un adulte sessile et larves nageuses, planctoniques. La plupart des 1 200 espèces de Bernaches vivent dans des eaux peu profondes et beaucoup sont souvent exposés à faible salinité. Une seule espèce, la baie balane Balanus (Amphibalanus) improvise (b. improvisus), peut tolérer presque d’eau douce et Charles Darwin décrit cette espèce d’un petit ruisseau dans l’estuaire du Rio de la Plata en Uruguay1. La salinité de tolow tolérance extrême rend improvisus b. , un modèle particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes osmorégulateur2,3. Ce barnacle préfère des conditions saumâtres, mais est capable de vivre dans les eaux des salinités de psu environ 1,6 à aussi haut que 40 bloc d’alimentation4. C’est l’espèce de barnacle seulement trouvée dans l’eaux saumâtres de la Baltique. B. improvisus est censé provenir de la côte est du continent américain mais aujourd'hui se trouve dans le monde entier en raison de la dispersion par expédition5. C’est un important organisme salissants et trouve couramment sur les rochers, jetées et les coques de bateau et est donc d’intérêt général pour la compréhension des mécanismes de l’encrassement biologique sur les constructions dans les eaux marines et saumâtres6,7.
Comme pour la plupart des autres Bernaches, b. improvisus est hermaphrodite avec multiples métissages ; la reproduction se fait par le biais de l’accouplement entre individus voisins utilisant un pénis allongé et la fécondation interne. La période de reproduction est principalement de mai à septembre. B. improvisus a sept stades larvaire pélagiques (six nauplii suivies d’un cypris étape8). Les écoutilles d’ovule fécondé en une larve nauplius qui est nageant librement et se nourrit dans la colonne d’eau pour jusqu'à plusieurs semaines avant la mue en une larve cypris sans alimentation. Les cypris utilise plusieurs indices pour trouver un emplacement convenable pour régler et puis subit une métamorphose dans une balane juvénile sessiles9. Les espèces peuvent être cultivées en laboratoire et ont une durée de vie de 1 à 2 ans dans la mer (2 à 3 ans en culture en laboratoire). En moyenne, b. improvisus jusqu'à 10 mm de diamètre (avec un maximum d’environ 20 mm) et atteint une hauteur maximale d’environ 6 mm (même si elle peut grandir dans des conditions surpeuplées). L’espèce peut être identifié par son enveloppe même calcaire lisse (blanc ou gris), la base de calcaire radialement à motifs de la plaque de la coquille et la forme des plaques tergal1,10.
La nonnette b. improvisus a plusieurs caractéristiques avantageuses comme un modèle pour les études d’osmorégulation, en mettant l’accent sur les mécanismes moléculaires et physiologiques ainsi que des interactions écologiques et des conséquences évolutives. Il est aussi largement utilisé comme modèle pour les enquêtes de régler la biologie, en particulier en ce qui concerne la recherche d’antifouling et les mécanismes impliqués7,11,12,13. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de larve cypris pour études. La capacité à la culture ce barnacle à travers son cycle de vie entier tout au long de l’année est, par conséquent, un atout majeur pour permettre à différents types d’études moléculaires et mécanistes. En outre, sa présence dans les eaux saumâtres/marine dans le monde entier permet une combinaison de terrain et les études expérimentales. Reproduction contrôlée peut également produire des familles des pedigrees connues pour la culture à long terme14, et un temps de génération de quelques mois peut permettre une évolution expérimentale à long terme. Il existe aussi un génome de projet et plusieurs transcriptions, et ces ressources ont été utilisées pour le clonage de plusieurs gènes (par exemple, les gènes d’importance dans l’osmorégulation)2,3.
Ce protocole vise à décrire comment établir et maintenir une culture de la nonnette b. improvisus tout au long de l’année afin d’effectuer des études d’expression génique sur adultes ou larves de cet organisme. Rittschof et al. 15 a brièvement décrit une méthode pour la culture des Bernaches de la libération de nauplies au règlement des cypris pour les espèces Balanus amphitrite. Le protocole a été adapté pour la culture tout au long de l’année des b. improvisus au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (Suède), et une description détaillée de toutes les étapes de la chaîne de production est exposée, y compris la production et l’élevage de barnacle les larves, ainsi que l’administration d’aliments pour les adultes et les larves. Pour un aperçu de l’ensemble de la procédure, voir la Figure 1. L’utilisation du système de culture est illustrée avec certaines configurations expérimentales communes et illustrée dans des études de génomique fonctionnelle de Na+/k+ ATPase et aquaporines, élucider leurs fonctions possibles à l’osmorégulation2, 3. Il est parfois essentiel d’étudier l’expression des gènes dans des tissus spécifiques, et quelques-unes des bases de la dissection barnacle seront couverts. Un bon approvisionnement en eau de mer de haute qualité, la mise en culture de la nonnette b. improvisuset potentiellement beaucoup d’autres espèces, devrait être possible dans les laboratoires marins dans le monde entier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1244px;" width="1243">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels</td>
			<td style="width:364px;">Plastic produkter, Bromma, Sweden</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:385px;">transparent glas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-L PET bottle</td>
			<td style="width:364px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artemia</td>
			<td>INVE Aquaculture, Belgium</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>We have tested different companies; this is really the best one</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1077/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)</td>
			<td style="width:364px;">CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&#160;</td>
			<td style="width:153px;">strain 1085/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millipore cartridge filter system</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cartridge with a nominal pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:364px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:153px;">cartridge CWSS01S03</td>
			<td>High capacity for large volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polycarbonate bottle</td>
			<td style="width:364px;">Nalgene</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>autoclavable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA later</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">76106</td>
			<td>&#160;Fixation solution to preserve RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:364px;">Invitrogen/Thermofisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>DNAse kit to remove DNA from prepared RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>cDNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green supermix</td>
			<td style="width:364px;">Biorad</td>
			<td>1708880</td>
			<td>Dye for QPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy minikit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction of adults or many cyprids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes</td>
			<td style="width:364px;">Precellys</td>
			<td style="width:153px;">KT03961-1-003.2</td>
			<td>Ceramic beads for homogenisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:364px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">74004</td>
			<td>RNA extraction of few cyprids</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression

Balanes sont des crustacés marins accompagné d’un adulte sessile et larves nageuses, planctoniques. La balane Balanus (Amphibalanus) improvisus est particulièrement pertinente comme un modèle pour l’étude des mécanismes de l’osmorégulation en raison de son extrême tolérance à la salinité faible. Il est aussi largement utilisé comme un modèle de décantation de biologie, en particulier en ce qui concerne la recherche d’antifouling. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de larve cypris pour études. Un protocole pour la culture tout au long de l’année des b. improvisus a été développé et une description détaillée de toutes les étapes de la chaîne de production est décrit (p. ex., la mise en place de cultures adultes sur les panneaux, la collecte et l’élevage du larves de balanes et l’administration d’aliments pour les adultes et les larves). Aussi, la description fournit des conseils sur le dépannage et discute des paramètres critiques (par exemple, l’élimination de la contamination, la production d’aliments de qualité, les effectifs nécessaires et l’importance de la qualité d’eau de mer). Chaque lot du système de culture au maximum donne environ 12 000 nauplies et peut livrer quatre lots dans une semaine, donc jusqu'à presque 50 000 larves par semaine peuvent être produites. La méthode utilisée pour la culture b. improvisus est, probablement, dans une large mesure également applicable à d’autres invertébrés marins avec libre-swimminglarvae. Protocoles sont présentés pour la dissection des tissus différents pour adultes ainsi que la production d’ARN de haute qualité pour les études sur l’expression génique. Il est également décrits comment des adultes et cypris élevés peuvent être utilisées dans un large éventail de conceptions expérimentales pour étudier l’expression des gènes en fonction de facteurs externes. L’utilisation de bernacles cultivées dans l’expression des gènes est illustrée avec des études de rôles osmorégulateurs possibles de Na+/k+ ATPase et aquaporines.

Avec la procédure décrite pour la mise en culture des balanes adultes de b. improvisus, jusqu'à quatre lots de nauplius larves peuvent être produits par semaine. Il serait possible de recueillir les larves nauplius presque tous les soirs, mais cela requiert plus de personnes et d’infrastructures (avec beaucoup de bernacles dans le stock de géniteurs, une culture publiera les larves en continu). Un autre facteur limitant pour la production de larves semble être la disponibilité des aliments de haute qualité, en particulier au sujet de la diatomée Skeletonema. Au maximum, chaque lot provenant du système de culture se compose d’environ 12 000 nauplius, jusqu'à 50 000 nauplius par semaine peut donc être cultivé. Cependant, quelques semaines, il peut y avoir jusqu'à dix fois moins les larves produites. Un seul adulte peut produire jusqu'à 7 000 larves par jour14, ce qui signifie que 1-2 adultes libèrent des larves pour chaque lot. Moins d’une semaine, environ 70 à 90 % des nauplies recueillies deviendra cypris (produisant environ 30 000 cypris par semaine, au maximum) qui peut être utilisé pour les essais de colonisation et les études moléculaires.
Il convient de souligner qu’il existe des variations dans les caractéristiques de cypris entre les lots, et en général, il y a des grandes variations entre les lots que dans les lots. Par exemple, le succès de décantation dans les essais de colonisation varie entre 30 et 70 % pour les différents lots. Probablement, cela est dû à la variation génétique individuelle entre les paires spécifiques des adultes libérant des larves pendant les périodes d’échantillonnage différentes. Il est, bien sûr, recommandé que les expériences répétées (réplique biologique) devraient inclure cypris d’un certain nombre de lots si les déclarations plus générales concernant les résultats doivent être effectués. La variation de lot met exigences sur le plan expérimental, où les contrôles appropriés et les normalisations en études d’expression de gène doivent être appliquées. Cependant, même après que plusieurs procédures de normalisation statistique ont été mises en œuvre qui réduisent considérablement la variation entre les lots, certains effets du lot sont habituellement toujours apparentes (données non publiées).
Suivant le protocole fourni, il est possible d’obtenir, en moyenne, 500 ng d’ARN de haute qualité de cypris aussi peu que 20, quel que soit le stade de l’établissement barnacle (tableau 1). La qualité de l’ARN est habituellement mesurée par le ratio entre les pics de 18 s et 28 (la position attendue des deux sommets sont indiqués à la Figure 4). Toutefois, dans le cas de balanes et beaucoup d’autres arthropodes, l’ARNr 28 s tombe en panne lorsqu’il est chauffé (dans le cadre de la méthode d’analyse) et migre avec le pic de 18 s20. C’est pourquoi il est, en principe, un seul pic de rRNA dans ce type d’analyse pour les balanes. Il ressort de ce test (Figure 4) qu’une homogénéisation de perles en céramique donne l’ARN la plus haute intégrité et qu’il est, par conséquent, la méthode de choix. L’ARN est suffisante en quantité et en qualité pour générer des bibliothèques de séquençage de haute qualité pour le séquençage, aboutissant à une moyenne de 70 millions de lectures par échantillon (le nombre de lectures, dépend bien sûr, le niveau du multiplexage au cours de la séquence). La quantité d’ARN est également suffisante pour l’ARNC synthèse et qPCR expression analyse d’un grand nombre de gènes.
La figure 5 illustre le résultat des analyses de qPCR d’aquaporines et de Na+/k+ ATPase (NAK1) splice variantes, où les modifications de l’expression ont été étudiées pour répondre aux changements dans les signaux environnementaux2,3. Une comparaison de l’expression relative de la longue et courte splice variantes de NAK1 montre une double augmentation pour l’ARNm NAK1 long faible salinité en ce qui concerne le court NAK (Figure 5A). Par conséquent, les données indiquent que l’épissage alternatif rend la forme longue prédominant dans des conditions de faible salinité. Dans le cas des aquaporines, il est évident que les deux paralogues transport de l’eau de AQP1 et AQP2 affichent l’expression différentielle (Figure 5B). En particulier, dans le tissu du manteau, il est évident que la AQP1 est nettement diminuées à des salinités inférieures, qui n’est pas considéré pour AQP2. Au lieu de cela, AQP2 affiche une expression légèrement accrue à des salinités inférieures, mais dans le soma. Ces résultats fournissent une base pour enquêtes des rôles fonctionnels des différents transporteurs ioniques b. improvisus et des aquaporines dans l’osmorégulation barnacle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de toute culture de procédure et l’extraction de l’ARN pour les études sur l’expression génique chez les adultes. Pour initier une nouvelle culture, les panneaux sont attachées à un cadre et déployé dans la mer à 1-3 m de profondeur. Après plusieurs semaines, les panneaux avec les adultes/adolescents sont placés verticalement dans les racks dans les bacs en laboratoire. Chaque plateau contient environ 40 panneaux avec des adultes. Avec environ 100 adultes par panneau, en total ≈ 4 000 individus adultes sont cultivées par plateau. Les balanes adultes sont nourris avec des artémias et peut être gardés an-autour. Les larves nauplius sont prélevés plusieurs fois par semaine depuis les plateaux via un filtrage à travers un tamis. Les nauplies collectées sont transférées à godets maintenue à 26 ° C dans un bain d’eau et nourris avec des microalgues. Nauplii sont élevés jusqu'à ce qu’ils muent dans cypris sans alimentation, qui sont perçus par le filtrage. Nouveaux panneaux peut être établi en laboratoire par la décantation des cypris sur panneaux, soit pour fournir de nouveaux panneaux pour l’année-autour de la culture, ou d’être utilisée pour spécifiques montages expérimentaux avec des conditions extérieures altérées. ARN est ensuite extrait de mineurs / d’adultes à la fin de l’expérience ou à des moments spécifiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg"> Figure 2 : Images de quelques étapes importantes dans la procédure culture. (A), cette image montre les images avec des panneaux de collecte de nouvelles populations sur le terrain. (B) cette image montre les panneaux avec des balanes adultes de b. improvisus dans les paniers qui sont placés dans des plateaux. Les panneaux sont placés environ 2 cm de distance. (C), cette image montre les plateaux avec la balane, panneaux et le réservoir d’alimentation à gauche. De chaque plateau, il y a une prise où les tamis sont placées pour la collecte des larves nauplius. (D) cette image montre que la production d’artémia d’alimentation pour les balanes adultes. (E) cette image montre l’élevage de nauplies en seaux placés dans un bain d’eau réglé à 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg"> Figure 3 : Description des étapes initiales de la dissection des balanes adultes : retirer le corps de sa coquille. Grab (A) une des plaques operculaires en insérant les pinces doucement à travers l’ouverture. Tirer doucement pour enlever la plaque et exposer l’animal. (B) retirer l’animal en saisissant la partie soma juste en dessous les cirres. (C), ce tableau montre l’anatomie générale de balanes acorn. Le manteau et potentiellement fécondés (dans l’ovaire) restent dans la cavité de la coquille lorsque le corps est tiré. Une note sur l’anatomie des balanes (pour un exposé plus approfondi, voir Anderson)9: les plaques murales d’une balane pente vers l’intérieur, et ensemble, elles forment un cône du volcan-like. Une ouverture, l’ouverture, est couverte par les deux plaques operculaires, qui forment une porte, ou l’opercule, pour fermer l’ouverture. Balanes Acorn ont généralement une plaque basale calcaire qui est collée fermement au substrat ; Cependant, certaines espèces de balanes n’ont pas ce plateau calcaire (p. ex., S. balanoides). Balanes sécrètent l’exosquelette du manteau fortement pigmenté (la carapace). La surface extérieure de la double couche du manteau est calcifiée pour devenir rigide, tandis que la surface intérieure du manteau n’est pas calcifiée et est donc flexible. À l’intérieur de l’ouverture, les cirres sont présentes en position rétractée. Ce sont les appendices thoraciques qui balanes utilisent pour l’alimentation de la suspension. Les ovaires sont situés à proximité de la base de la balane, tandis que les testicules se trouvent dans le soma. Ce chiffre a été adopté de Panova et al. 21 a été publié avec la permission de Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg"> Figure 4 : Détermination de l’intégrité des ARNr par électrophorèse capillaire. RNA a été préparé par deux méthodes différentes d’homogénéisation : la sonication (A) et (B) les perles en céramique. L’unité sur l’axe des ordonnées, FU, est synonyme d’unités de fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg"> Figure 5 : Expression génétique résulte de deux études différentes de gènes importants pour l’osmorégulation chez b. improvisus. (A), ce panneau indique l’expression différentielle telle que mesurée par qPCR de variants d’épissage de la Na+/k+ ATPase NAK1 en réponse à différentes salinités et BCP2 niveaux3. Dans le traitement de faible salinité, l’expression de l’isoforme longue (NAK1-L) est augmentée par rapport au court (ANOVA, P < 0,001). (B), ce panneau indique l’expression des aquaporines chez les adultes de b. improvisus lors de leur exposition aux différentes salinités2. qPCR a servi à déterminer les niveaux d’expression aquaporin relativement à l’actine. Les individus adultes ont été incubés à 3 différentes salinités (PSU 3, 20 et 33) pendant 14 jours. Pour la préparation d’ARN, le soma, les cirres et manteau des adultes ont été séparés. Dans les deux figures, barres d’erreur indiquent l’écart-type. Le ** et *** indiquent le niveau de signification (ANOVA), 0,01 à 0,001, respectivement. Ces chiffres ont été modifiés de Lind et al. 2 , 3. les deux chiffres sont publiés avec la permission de PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Phase de colonisation</td>
			<td>Montant total de l’ARN (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nage libre</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exploration : Recherche étroite</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cypris ci-joint</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nouvellement métamorphosés juvénile</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : rendements d’ARN. Ce tableau indique la quantité de RNA extraite avec un kit de préparation d’ARN de piscines de 20 individus de cypris recueillis à différentes étapes au cours du processus de règlement.

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The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

La balane Balanus (Amphibalanus) improvisus est un modèle pour étudier l’osmorégulation et antifouling. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de la larve cypris. Ici, un protocole pour la cultiver tout au long de l’année des b. improvisus est décrite, y compris la production de larves. L’utilisation de bernacles cultivées dans des études d’expression génique est illustrée.

balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Research

JoVE Journal

Environment

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Recherche

Environnement

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Démêler les joueurs invisibles dans l&#39;océan - un guide de terrain à la chimie de l&#39;eau et de microbiologie marine

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Un poisson-alimentation Laboratoire d&#39;essais biologiques pour évaluer l&#39;activité antiprédatrices des métabolites secondaires dans les tissus d&#39;organismes marins

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VACUSIP, une méthode Inex améliorée pour<em&gt; In Situ</em&gt; Mesure des particules et composés dissous transformés par suspensivores actifs

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

Développement de nouvelles méthodes de quantification de la densité des poissons à l’aide d’outils de stéréo-vidéo sous-marine

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Methods for Image-based Surveys of Benthic Macroinvertebrates and Their Habitat Exemplified by the Drop Camera Survey for the Atlantic Sea Scallop

Méthodes d’enquêtes axées sur l’Image de macroinvertébrés benthiques et de leur Habitat témoigne de l’enquête sur la caméra Drop pour le pétoncle Atlantique

Underwater imaging has long been used in the field of marine ecology but decreasing costs of high-resolution cameras and data storage have made the ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Culture individuelle de Tigriopus copépodes et analyse Quantitative de leur comportement Mate-gardiennage

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster (Nephrops norvegicus)

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster Nephrops norvegicus

Suivi à long terme de vidéo d’animaux aquatiques Cohoused : une étude de cas de l’activité locomotrice quotidienne de la langoustine (Nephrops norvegicus)

We present a protocol related to a video-tracking technique based on the background subtraction and image thresholding that makes it possible to ...

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Microfocus X-ray CT microCT Imaging of Actinia equina Cnidaria, Harmothoe sp. Annelida, and Xenoturbella japonica Xenacoelomorpha

Microfocus X-ray CT (microCT) Imagerie d'Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), et Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...